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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Aqui, é apresentado um protocolo para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos, usando exemplos de enzimas ligase, nuclease e polimerase. O ensaio utiliza oligonucleotídeos marcados e não marcados com fluorescência que podem ser combinados para formar duplexes que imitam danos ao RNA e/ou DNA ou intermediários da via, permitindo a caracterização do comportamento enzimático.

Abstract

A disponibilidade de uma variedade de oligonucleotídeos sintéticos modificados de fornecedores comerciais permitiu o desenvolvimento de ensaios sofisticados para caracterizar diversas propriedades de enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos que podem ser executadas em qualquer laboratório de biologia molecular padrão. O uso de rótulos fluorescentes tornou esses métodos acessíveis a pesquisadores com equipamento de eletroforese PAGE padrão e um gerador de imagens habilitado para fluorescência, sem usar materiais radioativos ou exigir um laboratório projetado para o armazenamento e preparação de materiais radioativos, ou seja, um Hot Lab. A adição opcional de modificações padrão, como a fosforilação, pode simplificar a configuração do ensaio, enquanto a incorporação específica de nucleotídeos modificados que imitam danos ao DNA ou intermediários pode ser usada para sondar aspectos específicos do comportamento enzimático. Aqui, o projeto e a execução de ensaios para interrogar vários aspectos do processamento de DNA por enzimas usando oligonucleotídeos sintéticos disponíveis comercialmente são demonstrados. Isso inclui a capacidade das ligases de se unirem ou nucleases de degradar diferentes estruturas híbridas de DNA e RNA, uso diferencial de cofatores pela DNA ligase e avaliação da capacidade de ligação ao DNA das enzimas. Fatores a serem considerados ao projetar substratos de nucleotídeos sintéticos são discutidos e um conjunto básico de oligonucleotídeos que podem ser usados para uma variedade de ensaios de enzimas ligase de ácido nucleico, polimerase e nuclease são fornecidos.

Introduction

Todas as formas de vida requerem enzimas de processamento de ácido nucleico para realizar processos biológicos fundamentais, incluindo replicação, transcrição e reparo de DNA. As principais funcionalidades enzimáticas para essas vias são polimerases, que geram cópias de moléculas de RNA/DNA, ligases que unem substratos polinucleotídeos, nucleases que os degradam e helicases e topoisomerases, que fundem duplex de ácidos nucleicos ou alteram sua topologia 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ....

Protocol

1. Projeto e compra de oligonucleotídeos

NOTA: Projete oligonucleotídeos de fita simples para serem montados e recozidos nos duplex desejados. Uma ou mais fitas de um duplex devem conter uma fração fluorescente para rastrear o processamento de oligonucleotídeos pela enzima de interesse. Um conjunto básico de sequências de fita simples que podem ser montadas para uma variedade de atividades é fornecido na Tabela 1.

  1. Incorporar as modificações.......

Representative Results

Ligação por DNA ligase
A atividade enzimática da DNA ligase resultará em um aumento no tamanho do oligonucleotídeo marcado com fluorescência quando visualizado em um gel PAGE de ureia. No caso dos substratos para ligação de DNA e RNA listados na Tabela 2, isso corresponde a uma duplicação de tamanho de 20 nt para 40 nt (Figura 3A). A atividade enzimática ideal pode ser determinada alterando as condições, como temperatura, concentração de pr.......

Discussion

Etapas críticas no protocolo
Projeto e compra de oligonucleotídeos: Ao comprar os oligonucleotídeos para formação duplex, é essencial considerar o design da sequência. Recomenda-se o uso de uma ferramenta de analisador de oligo para prever as propriedades da sequência de nucleotídeos, como conteúdo de GC, temperatura de fusão, estrutura secundária e potencial de dimerização, antes de solicitar57.

Montagem e recozimento de duplexes de á.......

Acknowledgements

AW é apoiado por uma Rutherford Discovery Fellowship (20-UOW-004). RS recebeu uma bolsa de estudos da New Zealand Post Antarctic. A SG e a UR agradecem ao Instituto de Química da Universidade de Tromsø - Universidade Norueguesa do Ártico pelo suporte técnico.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)BioRad1610156
Adenosine triphosphate (ATP)Many suppliers
Ammonium persulfate (APS)Many suppliers
Benchtop centrifugeMany suppliers
BorateMany suppliers
Bromophenol blueMany suppliers
Dithiothreitol (DTT)Many suppliers
Electrophoresis system with circulating water bathMany suppliers
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Many suppliers
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000Thermo Fisher ScientificA32752
FormamideMany suppliers
Gel casting systemMany suppliers
Heating blockMany suppliers
Magnesium ChlorideMany suppliersOther metal ions may be preferred depending on the protein studied
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)Many suppliers
Micropipettes and tipsMany suppliers1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)Many suppliers
OligonucleotidesIntegrated DNA TechnologiesNAThermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript and others also supply these
pasture pipetteMany suppliers
PCR thermocyclerMany suppliers
PCR tubesMany suppliers
RNAse awayThermoFisher7002PKOnly needed when working with RNA oligos
RNase AWAYMerck83931-250MLSurfactant for removal of RNAse contamination on surfaces
RNAse-free waterNew England BiolabsB1500LOnly needed when working with RNA oligos
Sodium ChlorideMany suppliers
SUPERase IN RNase inhibitorThermo Fisher ScientificAM2694Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)
SYBR GoldThermo Fisher ScientificS11494This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides
Tetramethylethylenediamine (TMED)Many suppliers
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethaneMany suppliers
Ultrapure water (Milli-Q)Merck
ureaMany suppliers
VortexMany suppliers

References

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