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Aqui, é apresentado um protocolo para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos, usando exemplos de enzimas ligase, nuclease e polimerase. O ensaio utiliza oligonucleotídeos marcados e não marcados com fluorescência que podem ser combinados para formar duplexes que imitam danos ao RNA e/ou DNA ou intermediários da via, permitindo a caracterização do comportamento enzimático.
A disponibilidade de uma variedade de oligonucleotídeos sintéticos modificados de fornecedores comerciais permitiu o desenvolvimento de ensaios sofisticados para caracterizar diversas propriedades de enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos que podem ser executadas em qualquer laboratório de biologia molecular padrão. O uso de rótulos fluorescentes tornou esses métodos acessíveis a pesquisadores com equipamento de eletroforese PAGE padrão e um gerador de imagens habilitado para fluorescência, sem usar materiais radioativos ou exigir um laboratório projetado para o armazenamento e preparação de materiais radioativos, ou seja, um Hot Lab. A adição opcional de modificações padrão, como a fosforilação, pode simplificar a configuração do ensaio, enquanto a incorporação específica de nucleotídeos modificados que imitam danos ao DNA ou intermediários pode ser usada para sondar aspectos específicos do comportamento enzimático. Aqui, o projeto e a execução de ensaios para interrogar vários aspectos do processamento de DNA por enzimas usando oligonucleotídeos sintéticos disponíveis comercialmente são demonstrados. Isso inclui a capacidade das ligases de se unirem ou nucleases de degradar diferentes estruturas híbridas de DNA e RNA, uso diferencial de cofatores pela DNA ligase e avaliação da capacidade de ligação ao DNA das enzimas. Fatores a serem considerados ao projetar substratos de nucleotídeos sintéticos são discutidos e um conjunto básico de oligonucleotídeos que podem ser usados para uma variedade de ensaios de enzimas ligase de ácido nucleico, polimerase e nuclease são fornecidos.
Todas as formas de vida requerem enzimas de processamento de ácido nucleico para realizar processos biológicos fundamentais, incluindo replicação, transcrição e reparo de DNA. As principais funcionalidades enzimáticas para essas vias são polimerases, que geram cópias de moléculas de RNA/DNA, ligases que unem substratos polinucleotídeos, nucleases que os degradam e helicases e topoisomerases, que fundem duplex de ácidos nucleicos ou alteram sua topologia 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ....
1. Projeto e compra de oligonucleotídeos
NOTA: Projete oligonucleotídeos de fita simples para serem montados e recozidos nos duplex desejados. Uma ou mais fitas de um duplex devem conter uma fração fluorescente para rastrear o processamento de oligonucleotídeos pela enzima de interesse. Um conjunto básico de sequências de fita simples que podem ser montadas para uma variedade de atividades é fornecido na Tabela 1.
Ligação por DNA ligase
A atividade enzimática da DNA ligase resultará em um aumento no tamanho do oligonucleotídeo marcado com fluorescência quando visualizado em um gel PAGE de ureia. No caso dos substratos para ligação de DNA e RNA listados na Tabela 2, isso corresponde a uma duplicação de tamanho de 20 nt para 40 nt (Figura 3A). A atividade enzimática ideal pode ser determinada alterando as condições, como temperatura, concentração de pr.......
Etapas críticas no protocolo
Projeto e compra de oligonucleotídeos: Ao comprar os oligonucleotídeos para formação duplex, é essencial considerar o design da sequência. Recomenda-se o uso de uma ferramenta de analisador de oligo para prever as propriedades da sequência de nucleotídeos, como conteúdo de GC, temperatura de fusão, estrutura secundária e potencial de dimerização, antes de solicitar57.
Montagem e recozimento de duplexes de á.......
A SEG e a UR são funcionários da ArcticZymes Technologies AS, que distribui a ligase R2D. AW, ER-S e RS não têm interesses concorrentes.
AW é apoiado por uma Rutherford Discovery Fellowship (20-UOW-004). RS recebeu uma bolsa de estudos da New Zealand Post Antarctic. A SG e a UR agradecem ao Instituto de Química da Universidade de Tromsø - Universidade Norueguesa do Ártico pelo suporte técnico.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1) | BioRad | 1610156 | |
Adenosine triphosphate (ATP) | Many suppliers | ||
Ammonium persulfate (APS) | Many suppliers | ||
Benchtop centrifuge | Many suppliers | ||
Borate | Many suppliers | ||
Bromophenol blue | Many suppliers | ||
Dithiothreitol (DTT) | Many suppliers | ||
Electrophoresis system with circulating water bath | Many suppliers | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Many suppliers | ||
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000 | Thermo Fisher Scientific | A32752 | |
Formamide | Many suppliers | ||
Gel casting system | Many suppliers | ||
Heating block | Many suppliers | ||
Magnesium Chloride | Many suppliers | Other metal ions may be preferred depending on the protein studied | |
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Many suppliers | ||
Micropipettes and tips | Many suppliers | 1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL | |
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) | Many suppliers | ||
Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | NA | Thermo Fisher, Sigma-Aldrich, Genscript and others also supply these |
pasture pipette | Many suppliers | ||
PCR thermocycler | Many suppliers | ||
PCR tubes | Many suppliers | ||
RNAse away | ThermoFisher | 7002PK | Only needed when working with RNA oligos |
RNase AWAY | Merck | 83931-250ML | Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces |
RNAse-free water | New England Biolabs | B1500L | Only needed when working with RNA oligos |
Sodium Chloride | Many suppliers | ||
SUPERase IN RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based) |
SYBR Gold | Thermo Fisher Scientific | S11494 | This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides |
Tetramethylethylenediamine (TMED) | Many suppliers | ||
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane | Many suppliers | ||
Ultrapure water (Milli-Q) | Merck | ||
urea | Many suppliers | ||
Vortex | Many suppliers |
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