Usando oligonucleotídeos sintéticos modificados para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos

Summary

Aqui, é apresentado um protocolo para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos, usando exemplos de enzimas ligase, nuclease e polimerase. O ensaio utiliza oligonucleotídeos marcados e não marcados com fluorescência que podem ser combinados para formar duplexes que imitam danos ao RNA e/ou DNA ou intermediários da via, permitindo a caracterização do comportamento enzimático.

Abstract

A disponibilidade de uma variedade de oligonucleotídeos sintéticos modificados de fornecedores comerciais permitiu o desenvolvimento de ensaios sofisticados para caracterizar diversas propriedades de enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos que podem ser executadas em qualquer laboratório de biologia molecular padrão. O uso de rótulos fluorescentes tornou esses métodos acessíveis a pesquisadores com equipamento de eletroforese PAGE padrão e um gerador de imagens habilitado para fluorescência, sem usar materiais radioativos ou exigir um laboratório projetado para o armazenamento e preparação de materiais radioativos, ou seja, um Hot Lab. A adição opcional de modificações padrão, como a fosforilação, pode simplificar a configuração do ensaio, enquanto a incorporação específica de nucleotídeos modificados que imitam danos ao DNA ou intermediários pode ser usada para sondar aspectos específicos do comportamento enzimático. Aqui, o projeto e a execução de ensaios para interrogar vários aspectos do processamento de DNA por enzimas usando oligonucleotídeos sintéticos disponíveis comercialmente são demonstrados. Isso inclui a capacidade das ligases de se unirem ou nucleases de degradar diferentes estruturas híbridas de DNA e RNA, uso diferencial de cofatores pela DNA ligase e avaliação da capacidade de ligação ao DNA das enzimas. Fatores a serem considerados ao projetar substratos de nucleotídeos sintéticos são discutidos e um conjunto básico de oligonucleotídeos que podem ser usados para uma variedade de ensaios de enzimas ligase de ácido nucleico, polimerase e nuclease são fornecidos.

Introduction

Todas as formas de vida requerem enzimas de processamento de ácido nucleico para realizar processos biológicos fundamentais, incluindo replicação, transcrição e reparo de DNA. As principais funcionalidades enzimáticas para essas vias são polimerases, que geram cópias de moléculas de RNA/DNA, ligases que unem substratos polinucleotídeos, nucleases que os degradam e helicases e topoisomerases, que fundem duplex de ácidos nucleicos ou alteram sua topologia 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ....

Protocol

1. Projeto e compra de oligonucleotídeos

NOTA: Projete oligonucleotídeos de fita simples para serem montados e recozidos nos duplex desejados. Uma ou mais fitas de um duplex devem conter uma fração fluorescente para rastrear o processamento de oligonucleotídeos pela enzima de interesse. Um conjunto básico de sequências de fita simples que podem ser montadas para uma variedade de atividades é fornecido na Tabela 1.

1. Incorporar as modificações.......

Discussion

Etapas críticas no protocolo
Projeto e compra de oligonucleotídeos: Ao comprar os oligonucleotídeos para formação duplex, é essencial considerar o design da sequência. Recomenda-se o uso de uma ferramenta de analisador de oligo para prever as propriedades da sequência de nucleotídeos, como conteúdo de GC, temperatura de fusão, estrutura secundária e potencial de dimerização, antes de solicitar⁵⁷.

Montagem e recozimento de duplexes de á.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)	BioRad	1610156
Adenosine triphosphate (ATP)	Many suppliers
Ammonium persulfate (APS)	Many suppliers
Benchtop centrifuge	Many suppliers
Borate	Many suppliers
Bromophenol blue	Many suppliers
Dithiothreitol (DTT)	Many suppliers
Electrophoresis system with circulating water bath	Many suppliers
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Many suppliers
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000	Thermo Fisher Scientific	A32752
Formamide	Many suppliers
Gel casting system	Many suppliers
Heating block	Many suppliers
Magnesium Chloride	Many suppliers		Other metal ions may be preferred depending on the protein studied
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Many suppliers
Micropipettes and tips	Many suppliers		1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)	Many suppliers
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	NA	Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript and others also supply these
pasture pipette	Many suppliers
PCR thermocycler	Many suppliers
PCR tubes	Many suppliers
RNAse away	ThermoFisher	7002PK	Only needed when working with RNA oligos
RNase AWAY	Merck	83931-250ML	Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces
RNAse-free water	New England Biolabs	B1500L	Only needed when working with RNA oligos
Sodium Chloride	Many suppliers
SUPERase IN RNase inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)
SYBR Gold	Thermo Fisher Scientific	S11494	This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides
Tetramethylethylenediamine (TMED)	Many suppliers
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane	Many suppliers
Ultrapure water (Milli-Q)	Merck
urea	Many suppliers
Vortex	Many suppliers