Progressi nella tecnologia degli organoidi bovini utilizzando interfacce monostrato per l'intestino tenue e crasso

Summary

Questo studio presenta un protocollo per la generazione di monostrati 2D intestinali bovini da organoidi, offrendo un migliore accesso per lo studio delle interazioni ospite-patogeno. Include metodi per valutare l'integrità e la funzionalità della membrana, avanzando modelli in vitro che imitano la fisiologia gastrointestinale del bestiame. Questo approccio promette significativi benefici biomedici e agricoli, tra cui strategie di trattamento avanzate.

Abstract

L'avanzamento delle conoscenze sulla fisiologia gastrointestinale e sulle sue malattie dipende in modo critico dallo sviluppo di modelli in vitro precisi e specie-specifici che imitino fedelmente i tessuti intestinali in vivo . Ciò è particolarmente importante per lo studio delle interazioni ospite-patogeno nei bovini, che sono serbatoi significativi di agenti patogeni che comportano gravi rischi per la salute pubblica. Gli organoidi 3D tradizionali offrono un accesso limitato alla superficie apicale dell'epitelio intestinale, un ostacolo superato dall'avvento delle colture monostrato 2D. Queste colture, derivate da cellule organoidi, forniscono una superficie luminale esposta per uno studio più accessibile. In questa ricerca, viene introdotto un protocollo dettagliato per la creazione e il mantenimento di colture monostrato 2D da cellule di organoidi bovini dell'intestino tenue e crasso. Questo metodo include protocolli per valutare l'integrità della membrana attraverso la resistenza elettrica transepiteliale e la permeabilità paracellulare insieme a tecniche di colorazione immunocitochimica. Questi protocolli gettano le basi per la creazione e la caratterizzazione di un sistema di coltura monostrato bovina 2D, spingendo i confini di queste applicazioni metodologiche nella ricerca biomedica e traslazionale di importanza per la salute pubblica. L'impiego di questo approccio innovativo consente lo sviluppo di modelli in vitro fisiologicamente pertinenti per esplorare sia gli stati normali che quelli malati della fisiologia intestinale dei bovini. Le implicazioni per i progressi biomedici e agricoli sono profonde e aprono la strada a trattamenti più efficaci per i disturbi intestinali dei bovini, migliorando così sia il benessere degli animali che la sicurezza alimentare.

Introduction

La coltura di cellule staminali epiteliali intestinali in colture tridimensionali (3D), note come organoidi intestinali, segna un progresso significativo nella tecnologia in vitro per lo studio delle funzioni intestinali, della nutrizione e delle interazioni con i patogeni ^1,2. Questi organoidi imitano la complessa struttura dell'epitelio intestinale in vivo autoreplicandosi e organizzandosi in formazioni 3D che comprendono varie linee cellulari intestinali³. Questa caratteristica evidenzia il loro notevole potenziale per far progredire la comprensione della biologia intestinale.

Il crescente interesse per l'applicazione della tecnologia degli organoidi intestinali agli animali da allevamento richiede il perfezionamento delle tecniche di coltura e mantenimento ^4,5. L'importanza di questa tecnologia è sottolineata dal suo potenziale impatto sullo studio della salute intestinale degli animali da allevamento, che svolge un ruolo critico nella loro produttività e, di conseguenza, nell'economia dell'industria alimentare-animale, influenzando il benessere degli animali e i costi operativi ^6,7. In particolare, l'impiego di colture di organoidi intestinali per esplorare la funzione intestinale dei bovini è di fondamentale importanza, dato il loro ruolo come serbatoi per patogeni enterici zoonotici, come Salmonella spp. ed Escherichia coli (E. coli) O157:H7⁸. Questi patogeni sono localizzati in particolari segmenti dell'intestino, il che rende essenziale differenziare i metodi di coltura degli organoidi intestinali per segmento intestinale per migliorare la precisione negli studi⁹.

Un ostacolo significativo nello studio degli organoidi intestinali è l'accesso limitato alla superficie apicale della cellula epiteliale¹⁰. Quando vengono coltivate all'interno di una matrice extracellulare (ECM), le cellule si orientano naturalmente in modo che la superficie basale sia rivolta verso l'esterno e la superficie apicale sia diretta verso l'interno¹⁰. Per affrontare questa sfida, vengono presentati metodi che prevedono la dissociazione di organoidi 3D in singole cellule e la loro semina in inserti di coltura cellulare semipermeabili. Questa configurazione stabilisce un'interfaccia tra la superficie apicale e un compartimento basolaterale. Questo protocollo dimostra che le cellule derivate da organoidi intestinali bovini possono formare un monostrato 2D coerente, come evidenziato dalle misurazioni della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e dai saggi di permeabilità paracellulare. Inoltre, lo sviluppo della polarità cellulare con bordi a spazzola e giunzioni strette nelle cellule monostrato 2D derivate da organoidi è confermato attraverso l'immunofluorescenza e la microscopia elettronica, riflettendo le proprietà dell'epitelio intestinale in vivo .

In questo studio, l'ileo rappresenta il tratto intestinale tenue e il retto indica il tratto intestinale crasso. Queste selezioni si basano su patogeni enterici rilevanti come Salmonella spp., che può traslocare l'ileo¹¹, ed E. coli O157:H7 noto per colonizzare principalmente il retto⁹ nei bovini. La selezione di questi specifici segmenti intestinali evidenzia la necessità di adattare i metodi di coltura degli organoidi intestinali alla regione intestinale per garantire la precisione nella ricerca. Questi metodi descrivono in dettaglio la procedura per coltivare efficacemente un'interfaccia monostrato 2D derivata da organoidi da questi segmenti intestinali, fornendo un modello robusto per esplorare la salute dell'intestino del bestiame, le infezioni da agenti patogeni e le interazioni tra il microbioma intestinale e l'ospite.

Protocol

Le cripte intestinali sono state ottenute da campioni intestinali in eccesso provenienti da un macello locale e la segnalazione dei donatori è fornita nella Tabella supplementare 1. Gli organoidi sono stati generati utilizzando tessuti derivati da animali che sono stati sottoposti a eutanasia umana in un macello e gli animali non sono stati acquistati esclusivamente per questa ricerca; pertanto, questo studio è esente dalla revisione IACUC e una dichiarazione etica non è applicabile.

1. Rivestimento ECM su inserti per colture cellulari per colture monostrato 2D derivate da organoidi

NOTA: Tutte le procedure vengono eseguite utilizzando materiali sterilizzati e tecniche asettiche in una cappa di biosicurezza. Tutti i reagenti vengono mantenuti in ghiaccio durante la procedura, salvo diversa indicazione.

1. Preparare 100 μl di ECM per il rivestimento di ogni inserto di coltura cellulare da 0,33 cm² mescolando accuratamente il terreno basale con idrogel a base di ECM al 2% (v/v) in una microprovetta.
2. Rimuovere l'inserto per colture cellulari individuali dalla confezione con una pinza sterilizzata e posizionarlo singolarmente nei pozzetti di una piastra per colture cellulari a fondo piatto trasparente a 24 pozzetti.
3. Applicare 100 μl di rivestimento ECM preparato nella fase 1.1 nella camera apicale di ciascun inserto di coltura cellulare preparato nella fase 1.2.
4. Riposizionare il coperchio e incubare la piastra per colture cellulari contenente gli inserti per colture cellulari rivestiti in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO₂ per 1 ora.
   1. Per le cellule organoidi ileali, l'inserto è pronto per l'uso dopo 1 ora di incubazione. Per le cellule organoidi rettali, dopo 1 ora di incubazione, sostituire il rivestimento ECM con un terreno di coltura rettale monostrato e incubare per una notte (Tabella 1). Preparare inserti di coltura cellulare aggiuntivi per i controlli in bianco, se si intende eseguire misure TEER.

	Ileo	Retto
Tempo di incubazione del rivestimento ECM	1 ora	1 ora seguita da Pernottamento in terreni di coltura monostrato
Integrazioni a terreno di coltura per organoidi
		CHIR99021
	LY2157299	LY2157299
	Y-27632	Y-27632
	Siero fetale bovino	Siero fetale bovino
Densità di semina cellulare (cellule/pozzetto)	5 x 105	3 x 105

Tabella 1: Sintesi del protocollo ottimizzato per la creazione di monostrati 2D derivati da organoidi ileali e rettali bovini adulti.

2. Semina di cellule organoidi bovine ileali e/o rettali e coltura 2D monostrato

NOTA: Il protocollo descritto in questa sezione utilizza organoidi ileali e rettali bovini, che sono stati coltivati e mantenuti su piastre a 48 pozzetti utilizzando le tecniche descritte⁵. Per ottenere risultati ottimali, si consiglia di utilizzare organoidi mantenuti in modo stabile che siano stati fatti passare più di 3 volte dopo l'insediamento iniziale e che siano stati coltivati per più di 3 giorni dopo il passaggio più recente.

1. Senza disturbare la cupola di idrogel basata su ECM contenente organoidi maturi, rimuovere i terreni di coltura degli organoidi utilizzando una pipetta Pasteur in vetro monouso collegata a un sistema a vuoto e aggiungere 300 μl di soluzione di depolimerizzazione ECM ghiacciata per pozzetto. Incubare per almeno 1 ora a 4 °C.
   NOTA: In alternativa, interrompere meccanicamente l'organoide contenente la cupola di idrogel a base di ECM dopo l'aggiunta della soluzione di depolimerizzazione ECM e raccogliere la sospensione in una provetta conica da 15 ml prima dell'incubazione a 4 °C. Questo metodo è consigliato quando organoidi che non sono destinati ad essere utilizzati per la coltura monostrato 2D vengono coltivati contemporaneamente sulla stessa piastra. La densità delle colture di organoidi influenza in modo significativo il numero di pozzetti di coltura di organoidi necessari per una semina ottimale negli inserti di coltura cellulare.
   1. Per le colture di organoidi ad alta densità (Figura 1A supplementare), gli inserti per colture di cellule rettali utilizzano un rapporto di semina compreso tra 1:1 e 1:2, il che significa che un pozzetto di coltura può seminare da uno a due pozzetti. Per l'ileo, mantenere il rapporto a 1:1. Al contrario, le colture a bassa densità (Figura supplementare 1B) richiedono più pozzetti di coltura; Utilizzare 3-4 pozzetti di coltura di organoidi rettali per un inserto di coltura di cellule rettali (rapporto 3-4:1) e 4-5 pozzetti di coltura di organoidi ileali per un inserto di coltura di cellule ileali (rapporto 4-5:1).
2. Ispezionare visivamente la dissoluzione completa dell'idrogel basato sulla ECM e raccogliere la sospensione di organoidi in una provetta conica da 15 mL.
3. Pellet di organoidi per centrifugazione a 200 x g e 4 °C per 5 min. Scartare il surnatante. Pellet di risospensione in 1 mL di soluzione dell'enzima di dissociazione cellulare ricombinante integrata con 10 μM di Y-27632.
4. Incubare la sospensione di organoidi in un bagno d'acqua a 37 °C per 10 minuti con agitazione intermittente di 3-5 s con un vortice ogni 2-3 minuti per facilitare un'efficace dissociazione degli organoidi.
5. Dopo la digestione enzimatica, aggiungere 5 mL di terreno basale e pipettare in modo aggressivo con una micropipetta P1000 per disgregare ulteriormente gli organoidi nelle singole cellule. Ispezionare la sospensione per verificare la presenza di grumi di organoidi e, se ancora visivamente apprezzabili, ripetere il pipettaggio per migliorare la dissociazione di singole cellule.
6. Preparare una provetta conica da 50 mL con un filtro cellulare da 70 μm. Prebagnare il colino applicando 1-2 ml di terreno basale.
7. Filtrare la sospensione delle celle attraverso il filtro per rimuovere i detriti residui di idrogel a base di ECM e i grandi grumi di cellule. Sciacquare la provetta originale da 15 ml e il filtro cellulare da 70 μm con altri 10 ml di terreno basale.
   NOTA: Se la sospensione cellulare non passa facilmente attraverso un colino, può essere un'indicazione di dissociazione incompleta dell'organoide. Si può tentare di ripassare la sospensione cellulare raccolta attraverso lo stesso filtro cellulare da 70 μm. Potrebbe essere necessario un ulteriore disturbo enzimatico o meccanico.
8. Sospensione monocellulare di pellet mediante centrifugazione a 200 x g e 4 °C per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule con un volume appropriato di terreno basale per eseguire la conta cellulare.
9. Contare le cellule vitali con un emocitometro dopo la colorazione con blu di tripano per calcolare il numero totale di cellule raccolte.
10. Sospensione monocellulare di pellet mediante centrifugazione a 200 x g e 4 °C per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule alla densità di semina appropriata nel rispettivo terreno di coltura monostrato (Tabella 1).
    1. Per le cellule organoidi ileali, risospendere le cellule alla concentrazione di 2,5 x 10⁶ cellule/mL per ottenere una densità di semina di 5 x 10⁵ cellule per inserto di coltura cellulare in 200 μL di terreno di coltura monostrato ileale, che è il terreno di coltura per organoidi integrato con 500 nM di LY2157299, 10 μM di Y-27632 e 20% di siero fetale bovino (FBS).
    2. Per le cellule organoidi rettali, risospendere le cellule alla concentrazione di 1,5 x 10⁶ cellule/mL per ottenere una densità di semina di 3 x 10⁵ cellule per inserto di coltura cellulare in 200 μL di terreno di coltura rettale monostrato, che è il terreno di coltura organoide integrato con 100 nM CHIR99021, 500 nM LY2157299, 10 μM Y-27632, e 20% FBS.
11. Recuperare la piastra per colture cellulari a 24 pozzetti con inserti per colture cellulari rivestiti in ECM e svuotare la camera apicale dell'inserto per colture cellulari con un'attenta aspirazione a vuoto per non interrompere il rivestimento.
12. Applicare delicatamente 200 μl di sospensione unicellulare preparata al punto 2.10 sulla camera apicale dell'inserto di coltura cellulare. Per il controllo del bianco, aggiungere 200 μl di terreno di coltura senza cellule nella camera apicale. Per il controllo del bianco, aggiungere 200 μl di terreno di coltura senza cellule nella camera apicale.
13. Applicare 500 μl di terreno di coltura monostrato opportunamente integrato (a seconda delle cellule ileali rispetto a quelle rettali) nella camera basolaterale di ciascun pozzetto.
14. Incubare in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO₂ per facilitare l'adesione e la crescita delle cellule e formare un monostrato 2D confluente sull'inserto della coltura cellulare.
15. Cambiare i terreni di coltura nelle camere apicali e basolaterali a giorni alterni a partire da 48 ore dopo la semina cellulare. Garantire lo stesso tempo di incubazione per il controllo in bianco e per l'inserto contenente le cellule.

3. Misurazione TEER

NOTA: Il metodo qui descritto utilizza un sistema di misurazione TEER manuale disponibile in commercio noto come voltohmmetro epiteliale con una coppia di elettrodi Ag/AgCl (Figura 1A). La determinazione del TEER su un monostrato 2D richiede la misurazione di pozzetti bianchi. Assicurarsi che la lettura in bianco venga effettuata allo stesso modo del campione.

1. Recuperare dall'incubatore la piastra contenente inserti per colture cellulari con monostrato 2D derivato da organoidi e il bianco. Lasciare che la piastra raggiunga la temperatura ambiente per circa 10 minuti.
2. Disinfettare gli elettrodi con etanolo al 70% e lasciarli asciugare completamente.
3. Introdurre con cautela gli elettrodi con l'estremità corta nella camera apicale e l'estremità lunga nella camera basolaterale (Figura 1A).
   NOTA: È necessaria la massima cautela per non interrompere il monostrato della cella.
4. Lasciare che la lettura si equilibri e registrare il valore in ohm quando si stabilizza.
   NOTA: La sensibilità del voltohmmetro è tale che si verificheranno fluttuazioni del valore ohm durante la misurazione della resistenza elettrica. Una lettura affidabile si ottiene quando le misurazioni si stabilizzano e si aggirano costantemente intorno a un valore di plateau.
5. Determinare il TEER del monostrato 2D con la seguente formula:
   TEER (Ω x cm²) = superficie degli inserti per colture cellulari (cm²) x Resistenza elettrica netta
   Dove la resistenza elettrica netta è uguale alla resistenza misurata dell'inserto monostrato della cella meno la resistenza misurata dell'inserto grezzo. Gli inserti per colture cellulari per piastre a 24 pozzetti hanno una superficie di 0,33 cm².

Figura 1: Valutazione dell'integrità della barriera epiteliale di un monostrato 2D derivato da organoidi intestinali bovini. (A) Schema del posizionamento appropriato degli elettrodi all'interno delle camere apicali e basolaterali di un inserto per colture cellulari per misure TEER. L'elettrodo corto viene inserito nella camera apicale e l'elettrodo lungo viene posizionato nella camera basolaterale con cura per evitare il contatto con la membrana. (B) Schema del processo di saggio di permeabilità. Le camere di coltura cellulare vengono lavate 2 volte con PBS riscaldato e 0,5 mg/mL di tracciante FITC-destrano da 4 kDa disciolto in PBS viene applicato alla camera apicale. Aliquote ripetute di 50 μl dalla camera basolaterale vengono campionate con la sostituzione di un volume uguale di PBS per mantenere il volume totale nella camera basolaterale per tutta la durata del periodo di incubazione. L'intensità di fluorescenza dell'aliquota viene misurata utilizzando un lettore di micropiastre per quantificare la diffusione del tracciante FITC-destrano da 4 kDa attraverso il monostrato cellulare. (C) Lo sviluppo dinamico dell'integrità della barriera all'interno dei monostrati ileale e rettale nel tempo è stato valutato utilizzando misurazioni TEER (rappresentate da cerchi chiusi per l'ileo e quadrati chiusi per il retto) e saggi di permeabilità (indicati da cerchi aperti per l'ileo e quadrati aperti per il retto) con un tracciante FITC-destrano da 4 kDa. Entro il terzo giorno di coltura, entrambi i tipi di monostrati hanno mostrato la creazione di barriere epiteliali stabili e funzionali, come evidenziato dai rispettivi profili di TEER e permeabilità. I risultati sono la media di almeno due esperimenti indipendenti con due repliche tecniche. Le barre di errore rappresentano il SEM delle misurazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Saggio di permeabilità paracellulare

NOTA: Questo test prevede la determinazione dell'intensità di fluorescenza risultante dalla diffusione dell'isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano dalla camera apicale alla camera basolaterale attraverso monostrati 2D per 120 minuti (Figura 1B). Per ottenere risultati ottimali, si consiglia di ridurre al minimo l'esposizione alla luce durante il saggio e di effettuare le misurazioni in un lettore di micropiastre immediatamente dopo ogni campionamento per evitare qualsiasi diminuzione o estinzione della fluorescenza. Ogni pozzetto può essere utilizzato una sola volta e non può essere riutilizzato in saggi successivi. Preparare almeno 2 pozzetti che fungano da repliche tecniche per ogni saggio. Ad esempio, sono necessari un totale di 6 pozzetti per ottenere i risultati presentati nella Figura 1C, dove i saggi sono stati eseguiti in duplice copia in 3 diversi punti temporali (giorni 1, 3 e 5 di coltura).

1. Preparare serie di diluizioni a curva standard con 4 kDa di FITC-destrano in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Per ogni diluizione, pipettare 50 μl in una piastra a 96 pozzetti in triplicato.
   NOTA: Si consiglia di creare una serie di 5-7 diluizioni che vanno da 0 a 0,5 mg/mL.
2. Determinare l'intensità di fluorescenza degli standard in un lettore di micropiastre pre-calibrato a una lunghezza d'onda di eccitazione di 495 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 535 nm.
3. Calcola la regressione lineare con i risultati dell'intensità della fluorescenza per creare una curva standard.
4. Recuperare dall'incubatore la piastra contenente inserti per colture cellulari con monostrato 2D derivato da organoidi. Rimuovere i terreni di coltura monostrato dalla camera apicale e basolaterale dell'inserto di coltura cellulare contenente il monostrato 2D derivato da organoidi da valutare.
5. Lavare delicatamente ciascuna camera 2 volte con 200 μl (camera apicale) e 500 μl (camera basolaterale) di PBS preriscaldato, rispettivamente.
6. Rimuovere la soluzione di lavaggio dalla camera apicale e applicare 200 μL di tracciante FITC-destrano da 0,5 mg/mL da 4 kDa in PBS nella camera apicale dell'inserto di coltura cellulare.
7. Incubare in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO₂ per 20 min.
8. Campionare 50 μl dalla camera basolaterale della piastra a 24 pozzetti incubata e trasferirlo in una piastra a 96 pozzetti compatibile con il lettore di micropiastre.
9. Sostituire 50 μl di PBS fresco nella camera basolaterale del pozzetto campionato.
10. Effettuare immediatamente la misurazione dell'intensità della fluorescenza in un lettore di micropiastre pre-calibrato a una lunghezza d'onda di eccitazione di 495 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 535 nm.
11. Ripetere i passaggi 4.6-4.10 ogni 20 minuti fino a 120 minuti. Al termine del saggio, se si desidera conservare il monostrato 2D, sciacquare sia la camera apicale che quella basolaterale con PBS 2x fresco, sostituire con terreno di coltura monostrato fresco e incubare.
    NOTA: È possibile eseguire ulteriori valutazioni dei monostrati 2D, ad esempio misurazioni TEER, colorazione in immunofluorescenza, ecc.; Tuttavia, non è raccomandato in quanto è probabile che il tracciante fluorescente residuo possa influire sull'analisi.
12. Determinare il coefficiente di permeabilità apparente (P_app) con la seguente formula:
    
    ΔQ / Δt = concentrazione di tracciante fluorescente che ha passato il monostrato alla camera basolaterale dell'inserto di coltura cellulare per un determinato periodo di tempo, misurata dall'intensità di fluorescenza ed estrapolata in μg/mL tramite la curva standard
    A = superficie degli inserti per colture cellulari
    C_o = concentrazione di tracciante fluorescente aggiunto alla camera apicale dell'inserto di coltura cellulare in μg/mL

5. Colorazione in immunofluorescenza di monostrato 2D derivato da organoidi

1. Rimuovere i terreni di coltura monostrato dall'inserto per colture cellulari con aspirazione a vuoto e aggiungere 200 μl di paraformaldeide (PFA) al 4%. Incubare a temperatura ambiente per 15-30 minuti per il fissaggio cellulare.
2. Rimuovere il PFA con l'aspirazione a vuoto e lavare con 100 μL di PBS 2x.
3. Permeabilizzare le cellule con 100 μL di Triton X-100 allo 0,3% in albumina sierica bovina al 2% (BSA) in PBS incubando a temperatura ambiente per 10 minuti.
4. Rimuovere il surnatante con aspirazione a vuoto e lavare con 100 μL di PBS 2x.
5. Rimuovere il surnatante e sostituirlo con il 2% di BSA in PBS e incubare a temperatura ambiente per 1 ora per il blocco.
6. Rimuovere il surnatante, applicare 100 μL di anticorpo primario diluito in BSA al 2% in PBS e incubare a temperatura ambiente per 1 ora o per una notte a 4 °C.
   NOTA: Le concentrazioni degli anticorpi primari utilizzati sono riportate nella Tabella dei materiali. Se non diversamente specificato, vengono seguite le raccomandazioni del produttore.
7. Rimuovere il surnatante e lavare con 100 μL di PBS 3x.
8. Applicare 100 μl di anticorpo secondario diluito in BSA al 2% in PBS e incubare a temperatura ambiente per 1 ora o per una notte a 4 °C.
   NOTA: Questo passaggio può essere saltato se l'anticorpo primario utilizzato è coniugato con una sonda a fluorescenza. Le concentrazioni degli anticorpi secondari utilizzati sono riportate nella Tabella dei materiali. Se non diversamente specificato, vengono seguite le raccomandazioni del produttore.
9. Rimuovere il surnatante e lavare con 100 μL di PBS 3x.
10. Opzionale: per la controcolorazione di F-actina e nuclei (DAPI), preparare mescolando entrambe le sonde a una diluizione appropriata (secondo le raccomandazioni del produttore) in PBS, applicare 100 μl e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Rimuovere il surnatante e lavare con 100 μL di PBS 3x.
11. Ritagliare con cura la membrana dell'inserto per colture cellulari con una lama di bisturi e montarla su un vetrino con una soluzione di montaggio. Metti un vetrino coprioggetto e osserva.

Discussion

La salute del tratto intestinale è fondamentale sia per la produttività che per il benessere generale dei bovini¹⁶. Sfruttando la tecnologia 2D monostrato derivata da organoidi, gli scienziati possono ora imitare in modo più accurato la complessa struttura dell'epitelio intestinale bovino in un contesto in vitro ⁵. Questo approccio innovativo non solo riproduce la diversa composizione cellulare del rivestimento intestinale, comprese le sue linee multicellulari, ma cattura anche caratteristiche funzionali chiave, come la secrezione di muco e la presenza di microvilli, essenziali per comprendere la fisiologia e la patologia intestinale³. Lo sviluppo di protocolli di coltura su misura per segmenti dell'ileo e del retto ha dato origine a una piattaforma avanzata che migliora significativamente la capacità di studiare la salute dell'intestino bovino. Questo approccio sofisticato consente di studiare in dettaglio le interazioni tra i patogeni zoonotici e l'ambiente intestinale bovino. La capacità di replicare e studiare da vicino gli aspetti unici dell'ecosistema intestinale bovino in vitro è un passo significativo verso lo sviluppo di strategie mirate per migliorare la salute del bestiame e mitigare la diffusione delle malattie zoonotiche.

Tuttavia, per garantire il successo dello sviluppo di monostrati 2D utilizzando organoidi intestinali bovini, è fondamentale mantenere la salute e la vitalità sia degli organoidi che delle loro singole cellule dissociate. Un'attenta manipolazione e la riduzione al minimo dello stress sono fondamentali per preservare l'integrità e la funzionalità delle cellule, essenziali per l'efficace crescita degli organoidi e la successiva creazione di un monostrato funzionante. Inoltre, il raggiungimento di un monostrato uniforme si basa sulla dissociazione riuscita degli organoidi in singole cellule senza formare grandi grumi. Tali grumi possono interrompere la distribuzione cellulare e compromettere la struttura del monostrato. Pertanto, l'impiego di tecniche precise per una dissociazione regolare è fondamentale, in quanto si ottiene una sospensione uniforme di una singola cellula. Inoltre, diventa utile ridurre al minimo i disturbi durante l'adesione cellulare e quando si lavano via le cellule non aderenti in eccesso. Questo approccio è particolarmente importante per affrontare potenziali problemi con la morfogenesi 3D, migliorando così la qualità complessiva del monostrato.

Una sfida nota con gli idrogel a base di ECM di origine biologica è la variazione da lotto a lotto nella composizione¹⁷. Sebbene ciò non sia stato osservato utilizzando i protocolli e i materiali descritti, le variazioni da lotto a lotto nella composizione dell'ECM potrebbero rappresentare una sfida per il successo dello sviluppo del monostrato. Se la formazione del monostrato è compromessa quando i prodotti, le marche o i numeri di lotto ECM cambiano, potrebbero essere necessarie fasi di ottimizzazione per determinare la concentrazione ECM appropriata richiesta per il rivestimento degli inserti per colture cellulari.

Inoltre, regolare il terreno di coltura a temperatura ambiente prima di apportare qualsiasi modifica è un passaggio fondamentale che aiuta a mitigare lo shock termico, proteggere la salute delle cellule e mantenere la qualità sia delle colture di organoidi che di monostrato. Anche le pratiche di lavaggio delicate sono fondamentali per mantenere l'integrità del monostrato durante la sua formazione e i successivi saggi, ed evitare interruzioni può prevenire imprecisioni nei risultati. La sostituzione del PBS con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) è sembrata utile per ridurre al minimo il distacco del monostrato quando diventava un problema durante il lavaggio ripetuto o l'esposizione prolungata al PBS, come nei saggi di permeabilità paracellulare. Infine, adattare il terreno di coltura per soddisfare le esigenze specifiche delle cellule provenienti da diversi segmenti del tratto intestinale, come l'ileo e il retto, è essenziale per replicare accuratamente le condizioni in vivo . Questa specificità garantisce una salute e una funzionalità cellulari ottimali, facilitando la modellazione precisa della fisiologia intestinale del bestiame e delle interazioni con i patogeni, evidenziando così queste fasi critiche nella ricerca sugli organoidi.

Oltre a impiegare una pratica delicata di manipolazione delle celle, lo sviluppo di una buona competenza tecnica associata al conteggio delle cellule e alle misure TEER è fondamentale per il successo dello sviluppo di un monostrato 2D funzionante. Poiché sia le densità di semina troppo basse che quelle troppo alte, risultanti rispettivamente da un conteggio eccessivo o insufficiente delle cellule, possono portare a una crescita compromessa del monostrato. Si consiglia di esaminare attentamente la conta cellulare e di garantire un'adeguata densità di semina nelle occasioni in cui si sospetta una densità di semina imprecisa. Inoltre, tecniche di misurazione TEER inadeguate possono causare l'interruzione del monostrato a causa di graffi involontari con gli elettrodi. Introdurre con cura gli elettrodi nella camera apicale e prestare particolare attenzione a mantenere il loro orientamento verticale rispetto alla superficie della membrana potrebbe aiutare a mitigare il rischio di danni accidentali ai monostrati.

I metodi di saggio della permeabilità paracellulare qui descritti sono stati adattati da un precedente protocollo¹⁸. Le modifiche al protocollo riportato, che includono campionamenti multipli superiori a 120 minuti e la sostituzione dell'aliquota campionata con quantità uguali di PBS, vengono apportate per migliorare l'accuratezza e l'affidabilità dei risultati. Mantenere il volume totale all'interno della camera è fondamentale per diversi motivi: preserva l'equilibrio osmotico, garantisce l'integrità delle cellule, mantiene il gradiente di concentrazione essenziale per un'accurata valutazione della permeabilità e previene le alterazioni della pressione idrostatica che potrebbero influire sulle velocità di trasporto. Questa pratica di riempire la camera basolaterale con PBS fresco equivalente al volume del PBS contenente tracciante fluorescente campionato è fondamentale per preservare queste condizioni, consentendo valutazioni accurate e significative della permeabilità del monostrato. Il test di permeabilità paracellulare funge da complemento alla misurazione TEER, valutando direttamente il movimento delle molecole traccianti attraverso il monostrato. Inoltre, il confronto dei valori TEER tra vari laboratori potrebbe non fornire informazioni rilevanti, poiché questi valori possono essere influenzati da numerose variabili, come la temperatura e le condizioni specifiche in cui le cellule vengono coltivate, inclusi i tipi di cellule, il numero di passaggi e la composizione del terreno di coltura¹⁹. Il test di permeabilità paracellulare fornisce una valutazione funzionale in vitro dell'efficace espressione di aderenze e giunzioni strette all'interno di una barriera epiteliale²⁰.

Sebbene lo sviluppo di monostrati 2D da organoidi 3D rappresenti un progresso significativo nella tecnologia delle colture, è importante riconoscere i limiti associati ai monostrati 2D. Uno dei principali svantaggi è che questo rimane un sistema di coltura statico, privo della stimolazione dinamica che si trova nell'ambiente in vivo . Inoltre, la modifica del contenuto di ossigeno all'interno del sistema di coltura presenta sfide a causa della sua configurazione aperta che prevede piastre di coltura con coperchi, rendendolo meno adatto per la co-coltura a lungo termine con batteri anaerobici. Queste limitazioni potrebbero potenzialmente essere affrontate adottando piattaforme di coltura più dinamiche, come i sistemi microfluidici²¹, che offrono un ambiente più controllato e fisiologicamente rilevante. Inoltre, è fondamentale riconoscere che, sebbene le attuali condizioni di coltura siano ricche di nutrienti benefici per il mantenimento della crescita delle cellule staminali, potrebbero non essere ottimali per indurre la differenziazione fisiologica delle cellule epiteliali. Questa discrepanza evidenzia la necessità di un'ottimizzazione nella ricerca futura per imitare da vicino le condizioni in vivo e supportare il processo di differenziazione. Affrontando queste limitazioni e perfezionando questi approcci, l'utilità e l'applicabilità delle tecnologie di coltura degli organoidi vengono migliorate, avvicinandosi alla replica delle complesse dinamiche e interazioni del tratto gastrointestinale in vitro.

Il protocollo per la generazione di monostrati 2D da tessuti ileali e rettali bovini offre ai ricercatori un prezioso modello in vitro dell'interfaccia luminale dell'epitelio dell'intestino tenue e crasso. Questo modello apre vaste possibilità di applicazione negli studi fondamentali sulla nutrizione animale, in particolare nell'esame di come i nutrienti vengono assorbiti in varie condizioni. Un'area di notevole interesse è lo studio della sindrome dell'intestino permeabile, caratterizzata da un aumento anomalo della permeabilità gastrointestinale, spesso innescato da cambiamenti nella dieta e temperature ambientali estreme ^22,23. Inoltre, questo modello funge da strumento essenziale per esplorare le complesse interazioni tra il microbioma intestinale e il suo ospite. Consente lo studio di come i microrganismi commensali possono influenzare la salute dell'organismo ospite, affrontando un aspetto cruciale della scienza veterinaria e medica ^1,24. Inoltre, i patogeni di origine alimentare umana si trovano spesso come commensali in diversi segmenti dell'intestino del bestiame ^8,9,25, questo protocollo consente studi dettagliati delle condizioni specifiche che consentono a questi agenti zoonotici di prosperare nelle rispettive nicchie.

Nel corso di questo studio, è stato osservato che i monostrati derivati da organoidi rettali e ileali richiedono condizioni diverse per uno sviluppo di successo. In particolare, quando i monostrati derivati da organoidi rettali sono stati inizialmente seminati su inserti di coltura cellulare preparati con idrogel a base di ECM al 2% in terreno basale per 1 ora, sono stati notati fori di grandi dimensioni e desquamazione cellulare. Questo problema è stato risolto passando a un terreno di coltura monostrato rettale specializzato ed estendendo il periodo di incubazione alla notte prima della semina, mentre i monostrati derivati da organoidi ileali sono stati sviluppati con successo utilizzando un protocollo di preparazione più breve. Inoltre, l'aggiunta di CHIR99021 al terreno di coltura ha costantemente migliorato la formazione di monostrati rettali²⁶ , ma non è stata necessaria per i monostrati ileali²⁷. Inoltre, i monostrati ileali richiedevano una densità cellulare più elevata per uno sviluppo di successo rispetto agli organoidi rettali²⁷. Queste condizioni ottimizzate (Tabella 1) hanno ripetutamente sviluppato monostrati che mantengono l'integrità della barriera resistente, sottolineando l'importanza di adattare le condizioni di coltura allo specifico segmento intestinale.

L'accesso a un modello che rifletta accuratamente la complessità del lignaggio multicellulare dell'intestino in vivo è fondamentale per queste indagini. Consente ai ricercatori di imitare da vicino le condizioni naturali dell'ambiente intestinale, fornendo una base più affidabile per gli esperimenti. Con questo protocollo, i ricercatori sono dotati di un modello robusto che migliora le loro capacità di ricerca, portando potenzialmente a scoperte rivoluzionarie nei loro campi di studio. Questo approccio non solo contribuisce a comprendere la salute e le malattie intestinali, ma aiuta anche nello sviluppo di strategie per migliorare la gestione del bestiame e la sicurezza alimentare.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Basal Medium
Advanced DMEM/F12 (1X)	Gibco	12634-010	n/a
GlutaMAX-I (100X)	Gibco	35050-061	2 mM
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	10 mM
Pen Strep Glutamine (100X)	Gibco	10378-016	1X
Organoid Culture Medium (Supplements to Basal Medium)
A-83-01	Sigma-Aldrich	SML0788-5MG	500 nM
B27 Supplement (50X)	Gibco	17504-001	1X
[Leu15]-Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145-.5MG	10 nM
Murine EGF	PeproTech	315-09-500UG	50 ng/mL
Murine Wnt-3a	PeproTech	315-20-10UG	100 ng/mL
N-Acetyl-L-cysteine	MP Biomedicals	194603	1 mM
N-2 MAX Media Supplement (100X)	R&D Systems	AR009	1X
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G	10 mM
Noggin Conditioned Medium	n/a	n/a	10 vol/vol %
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	100 µg/mL
R-Spondin-1 Conditioned Medium	n/a	n/a	20 vol/vol %
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067-25MG	10 µM
Monolayer Culture Medium (Supplements to Organoid Culture Medium)
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046-5MG	2.5 µM
HI FBS	Gibco	10438-034	20 vol/vol %
LY2157299	Sigma-Aldrich	SML2851-5MG	500 nM
Y-27632	StemCellTechnologies	72308	10 µM
Reagents
Alexa Fluor 488 Mouse anti-E-cadherin	BD Biosciences	560061	1:200 dilution
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Invitrogen	A22287	1:400 dilution
BSA	Cytiva	SH30574.02	2 w/vol %
Cell Recovery Solution	Corning	354253	n/a
DAPI Solution (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248	1:1000 dilution
DPBS (1X)	Gibco	14190-144	n/a
Fluorescein Isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	FD4-100MG	0.5 mg/mL
Matrigel Matrix	Corning	354234	n/a
Paraformaldehyde Solution (4%)	Thermo Scientific	J19943K2	n/a
ProLong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36930	n/a
SNA, EBL, Fluorescein	Vector Laboratories	FL-1301	1:100 dilution
Triton X-100	Thermo Scientific	A16046.AE	0.3 vol/vol %
TrypLE Express	Gibco	12605-028	n/a
Trypan Blue Solution, 0.4%	VWR Life Science	K940-100ML	n/a
Materials and Equipment
0.4 µm Cell Culture Insert	Falcon	353095
24-well Cell Culture Plate	Corning	3524
48-well Cell Culture Plate	Thermo Scientific	150687
70 µm Sterile Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-548
96-well Cell Culture Plate	Greiner Bio-One	655086
Centrifuge	Eppendorf	5910Ri
CO2 Incubator	Thermo Scientific	370
Epithelial Volt-Ohm Meter	Millipore	Millicell ERS-2
Hemocytometer	LW Scientific	CTL-HEMM-GLDR
Inverted Confocal Microscope	Leica Microsystems	SP8-X
Inverted Phase-Contrast Microscope	Leica Microsystems	DMi1
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-540-B
Microplate Reader	Molecular Devices	SpecrtraMax i3x
Microscope Slides	Fisher Scientific	22-034-486
Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20C
Scalpel Blade	iMed Scientific	-	#11 carbon steel
Vortex Mixer	Scientific Industries	SI-0236
Software
LAS X imaging software	Leica Microsystems	LAS X 3.7.6.25997
Microplate Reader software	Molecular Devces	SoftMax Pro 7.1.2