この研究は、中国国家自然科学基金会(No.81800207)からJ.H.への助成金によって支援されました。Beckman Coulter, Inc.のフローサイトメトリーとパラメータキャリブレーションのサポートにご協力いただき、大変感謝しています。フローサイトメトリーデータ取得にご協力いただいた四川大学西中国口腔病病院口腔疾患国家重点研究所のJiao Chen氏と、四川大学華西病院再生医療研究センターのYu Qi氏に感謝いたします。

この研究の実験では、8週齢から12週齢のC57BL/6マウスを合計10匹利用しました。実験的な操作は、四川大学の動物施設管理および使用委員会(#201609309)によって承認されたプロトコルに従って行われました。この記事で使用した実験材料とフローサイトメトリーのパラメータは、 材料の表に記載されています。
1. マウス骨髄細胞の単離と採取
<ol><l...

サイドポピュレーション細胞の検出を容易にする代替レーザー励起法

<ol>
	<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies.">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li><li>Challen, G. A., Boles, N. C., Chambers, S. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+hematopoietic+stem+cell+subtypes+are+differentially+regulated+by+TGF-beta1.">Distinct hematopoietic stem cell subtypes are differentially regulated by TGF-beta1.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 265-278 (2010).</li><li>Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+specification+of+side+population+cells+in+skeletal+muscle.">Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).</li><li>Terrace, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+in+developing+human+liver+are+primarily+haematopoietic+progenitor+cells.">Side population cells in developing human liver are primarily haematopoietic progenitor cells.</a> Exp Cell Res. 315 (13), 2141-2153 (2009).</li><li>Martin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+lung+side+population+cells+have+mesenchymal+stem+cell+potential.">Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential.</a> Cytotherapy. 10 (2), 140-151 (2008).</li><li>Challen, G. A., Bertoncello, I., Deane, J. A., Ricardo, S. D., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+side+population+reveals+multilineage+potential+and+renal+functional+capacity+but+also+cellular+heterogeneity.">Kidney side population reveals multilineage potential and renal functional capacity but also cellular heterogeneity.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1896-1912 (2006).</li><li>Mouthon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+from+mouse+forebrain+are+contained+in+a+population+distinct+from+the+'side+population'.">Neural stem cells from mouse forebrain are contained in a population distinct from the 'side population'.</a> J Neurochem. 99 (3), 807-817 (2006).</li><li>Cordon-Cardo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells.">Cancer stem cells.</a> Ann Oncol. 21 (Suppl 7), 93-94 (2010).</li><li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice.">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li><li>Yun, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+in+castration-resistant+prostate+cancer.">Targeting cancer stem cells in castration-resistant prostate cancer.</a> Clin Cancer Res. 22 (3), 670-679 (2016).</li><li>Lupia, M., Cavallaro, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+stem+cells:+still+an+elusive+entity.">Ovarian cancer stem cells: still an elusive entity.</a> Mol Cancer. 16 (1), 64 (2017).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AQP5+complements+LGR5+to+determine+the+fates+of+gastric+cancer+stem+cells+through+regulating+ULK1+ubiquitination.">AQP5 complements LGR5 to determine the fates of gastric cancer stem cells through regulating ULK1 ubiquitination.</a> J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 322 (2022).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+lncRNA+ROPM-mediated+lipid+metabolism+governs+breast+cancer+stem+cell+properties.">A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties.</a> J Hematol Oncol. 14 (1), 178 (2021).</li><li>Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+human+lung+cancer+cell+lines+and+tumors+is+enriched+with+stem-like+cancer+cells.">Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells.</a> Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).</li><li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties.">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li><li>Haraguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+side+population+of+cancer+cells+from+human+gastrointestinal+system.">Characterization of a side population of cancer cells from human gastrointestinal system.</a> Stem Cells. 24 (3), 506-513 (2006).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+PTEN/mTOR/STAT3+pathway+in+breast+cancer+stem-like+cells+is+required+for+viability+and+maintenance.">Activation of the PTEN/mTOR/STAT3 pathway in breast cancer stem-like cells is required for viability and maintenance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 16158-16163 (2007).</li><li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells.">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Sci. 107 (4), 433-443 (2016).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALCAM+regulates+multiple+myeloma+chemoresistant+side+population.">ALCAM regulates multiple myeloma chemoresistant side population.</a> Cell Death Dis. 13 (2), 136 (2022).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homoharringtonine+synergizes+with+quizartinib+in+FLT3-ITD+acute+myeloid+leukemia+by+targeting+FLT3-AKT-c-Myc+pathway.">Homoharringtonine synergizes with quizartinib in FLT3-ITD acute myeloid leukemia by targeting FLT3-AKT-c-Myc pathway.</a> Biochem Pharmacol. 188, 114538 (2021).</li><li>Dong, X. L., Wei, Y. Y., Xu, T., Tan, X. Y., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+side+population+in+solid+tumor+cell+lines.">Analysis of side population in solid tumor cell lines.</a> J Vis Exp. (168), e60658 (2021).</li><li>Bhowmick, D., Sheridan, R. T. C., Bushnell, T. P., Spalding, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+guidelines+for+optimization+and+characterization+of+the+Beckman+Coulter+CytoFLEX+platform.">Practical guidelines for optimization and characterization of the Beckman Coulter CytoFLEX platform.</a> Cytom Part A. 97 (8), 800-810 (2020).</li></ol>

記載されているプロトコルを使用して3つの実験を行い、各試験には3〜4匹のマウスを使用し、合計10匹のマウスを作成しました。SP細胞の割合は0.05%から0.76%の範囲であった。マウス間で個々の変動が観察されたことに注意することが重要です。4つのフローサイトメーターを使用して、Hoechstサンプルを分析しました。新しいバージョンのフローサイトメトリーでの20 mW 355 nmレーザーによるHoechs...

サイドポピュレーション(SP)細胞は、Hoechst 33342染色によって同定され、フローサイトメトリー(FCM)を使用して分析されます。SP細胞は、それらのATP結合カセット(ABC)トランスポーター1,2を介して、蛍光DNA色素を細胞からポンピングすることを特徴としている。この方法はもともと、マウスの骨髄造血幹細胞(HSC)を単離するために確立されました1。骨髄SP細胞は、CD117+Sca-1+Lin-Thy1低発現3,4を特徴とするHSCの集団で濃縮されました。その後、この方法は、心筋5、肝臓6、肺7、腎臓8、および前脳9などの他の組織から幹細胞を単離し、濃縮するために広く使用されました。特に、この方法は過去10年間でがん幹細胞(CSC)の単離に適用されてきました。CSCは、腫瘍の開始、自己再生、化学療法に対する耐性、および転移性の特性を持つ細胞の小さな集団を表しています10。CSCは、最初に造血悪性腫瘍11で同定され、その後、前立腺12、卵巣13、胃14、乳房15、および肺16癌などのさまざまな固形腫瘍で観察されました。CSCの同定にはさまざまな技術がありますが、SP技術は、多様な組織や細胞株に幅広く適用できるため、依然として好まれる選択肢です。さらに、これは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)16,17,18を用いてCSCを単離する貴重な技術である。実験結果は、SP細胞が顕著な腫瘍原性を示し、幹細胞関連遺伝子の発現レベルが高いことを示しています19,20。私たちの以前の研究21では、多発性骨髄腫で単離されたSP細胞のトランスクリプトーム分析により、ヘッジホッグ経路などの幹細胞に関連するシグナル伝達経路の濃縮が明らかになることも示されました。一方、急性骨髄性白血病のSP細胞で差次的に発現する遺伝子のパスウェイエンリッチメント解析を行った22。改変された遺伝子は、幹細胞関連経路(Wnt/β-カテニン、TGF-β、ヘッジホッグ、ノッチ)に富んでいました。その結果、BALB/c欠損マウス22では1×105 SP細胞が腫瘍を形成できるのに対し、非SP細胞は腫瘍を形成できないことがわかったことから、SP細胞は白血病幹細胞の特徴を持っていることが示された。CSCの同定におけるHoechst SP法の有効性は明らかです。
Hoechst SPのプロトコールは、研究の進展を通じて洗練され、強化されてきました。このプロトコルでは、色素濃度、細胞密度、インキュベーション温度とインキュベーション時間、緩衝液組成、およびpH値を厳密に制御する必要があります。このプロトコルに従って調製した細胞サンプルをフローサイトメトリー分析に供した。355 nmのUVレーザーによるHoechst色素の励起と、690/50 nmフィルター(Hoechst Red)と450/50 nmフィルター(Hoechst Blue)の両方を使用してその蛍光発光を検出するため、FCMには350 nmレーザーが必要です。ただし、350 nmレーザーはコストが高いため、ほとんどのFCMには一般的に装備されていません。したがって、フローサイトメトリーによるSP細胞の効果的な検出のための色素励起の代替アプローチを見つけることを試みました。この研究では、375 nmおよび405 nmレーザーのSP細胞検出能力を評価し、355 nmレーザーの能力と比較しました。私たちの発見は、355 nm、375 nm、および405 nmのレーザーによって検出されたSP細胞間の顕著な類似性を示しています。これらの結果は、高出力の375nmおよび405nmレーザーが、SP細胞検出のための355nmレーザーの実行可能な代替手段として役立つことを示唆しています。Hoechst 33342 には励起光源を追加することで、より多くのフローサイトメトリーモデルの使用が容易になります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>1M1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Filter(100 &#181;m)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CSS-013-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daily quality control fluorospheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>10-013-CVRC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>35-081-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30030.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effective detection of hoechst side population cells by flow cytometry

サイドポピュレーション(SP)細胞は、Hoechst 33342染色によって同定され、フローサイトメトリー(FCM)を使用して分析されます。Hoechst SP法は、ATP結合カセット(ABC)トランスポーターの色素排出特性に基づく幹細胞の単離に利用されています。この方法は当初、造血幹細胞(HSC)の同定と単離に採用されましたが、現在では主にがん幹細胞(CSC)の同定と単離に焦点を当てるように進化しています。FCMの従来の検出法では、355 nmレーザーを使用して色素を励起し、SP細胞を検出します。この研究を通じて、355 nmレーザーを使用したSP細胞の検出を効果的に置き換えることができる色素励起の代替アプローチを特定することに成功しました。これは、高出力の375nmまたは405nmレーザーを利用することで実現されます。これにより、355 nmレーザーフローサイトメトリーのみに限定されるのではなく、SP細胞の検出において選択性を高めることができます。

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The SP cells are characterized by the pumping of the fluorescent DNA dye out of the cells through their ATP-binding cassette (ABC) transporter1,2. The method was originally established for isolating murine bone marrow hematopoietic stem cells (HSCs)1. The bone marrow SP cells were enriched with a population of HSCs characterized by &#160;CD117+Sca-1+Lin-Thy1low&#160;expression3,4. Thereafter, the method was widely used to isolate and enrich stem cells from other tissues, including cardiac muscle5, liver6, lung7, kidney8, and forebrain9. In particular, the method has been applied to isolate cancer stem cells (CSCs) in the past decade. CSCs represent a small population of cells that possess the properties of tumor initiation, self-renewal, resistance to chemotherapy, and metastatic potential10. CSCs were initially identified in hematopoietic malignancies11 and subsequently observed in various solid tumors such as the prostate12, ovarian13, gastric14, breast15, and lung16 carcinomas. Despite the availability of various techniques for CSC identification, the SP technique remains a favored choice owing to its broad applicability across diverse tissues and cell lines. Moreover, it is a valuable technique that isolates CSCs using fluorescence-activated cell sorting (FACS)16,17,18. The experimental findings demonstrate that SP cells exhibit pronounced tumorigenicity and display elevated expression levels of stem cell-associated genes19,20. Our previous study21 has also demonstrated that transcriptomic analysis of isolated SP cells in multiple myeloma reveals enrichment of signaling pathways associated with stem cells, such as the hedgehog pathway. Meanwhile, we performed pathway enrichment analyses on the genes differentially expressed in the SP cells of acute myelogenous leukemia22. The altered genes were enriched in stem cell-related pathways (Wnt/&#946;-catenin, TGF-&#946;, Hedgehog, Notch). We found that 1 x 105 SP cells could form tumors in BALB/c null mice22, whereas non-SP cells could not, indicating that SP cells had characteristics of leukemia stem cells. The efficacy of the Hoechst SP method in the identification of CSCs is evident.
The Hoechst SP protocol has been refined and enhanced through the progression of research. The protocol entails stringent control of the dye concentration, cell density, incubation temperature and duration, buffer composition, and pH value. The cell samples prepared in accordance with this protocol were subjected to flow cytometric analysis. Due to the excitation of Hoechst dye with a UV laser at 355 nm and detection of its fluorescence emission using both a 690/50 nm filter (Hoechst Red) and 450/50 nm filter (Hoechst Blue), a 350 nm laser is required for FCM. However, 350 nm lasers are not commonly equipped in most FCMs because of their high cost. Hence, we attempted to find an alternate approach for&#160;dye excitation for the effective detection of SP cells by flow cytometry. In this study, the capability of the 375 nm and 405 nm lasers in detecting SP cells was assessed and compared with that of the 355 nm laser. Our findings demonstrate a remarkable similarity between the SP cells detected by the 355 nm, 375 nm, and 405 nm lasers. These results suggest that the high-power 375 nm and 405 nm lasers can serve as feasible alternatives to the 355 nm laser for SP cell detection. The inclusion of additional excitation light sources for Hoechst 33342 facilitates the use of more flow cytometry models.

著者スポットライト:サイド集団細胞を分析するためのヘキスト染色のための革新的なレーザー技術

フローサイトメトリーによるHoechst側集団細胞の効果的な検出

図2では、対照群をベラパミルで処理し、幹細胞中のABCトランスポーターをブロックしてHoechst 33342の排除を防止しました。これにより、非ベラパミル基の幹細胞はヘキスト33342を排出し、SP細胞として知られる陰性細胞集団を形成します。355 nmレーザーはHoechst 33342色素を効果的に励起し、骨髄のSP細胞を鮮明に観察しました(図2A)。355 nmレーザーと405...

ここでは、高出力の375 nmおよび405 nmレーザーがHoechst 33342を効果的に励起し、サイドポピュレーション(SP)細胞検出用の355 nmレーザーの実行可能な代替品として機能することを示し、それによりフローサイトメトリーアプリケーションで利用可能なレーザーの範囲が広がります。

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The Hoechst SP method is utilized ...

フローサイトメトリーによるHoechst側集団細胞の効果的な検出

Abstract