هذه الدراسة مدعومة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82101145) ومؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (Z200014).

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية لمستشفى بكين تونغرن ، جامعة العاصمة الطبية. كان خط خلية HESCs H9 من معهد أبحاث WiCell. قم بتسخين وسط زراعة الخلايا مسبقا في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة قبل التجربة.
1. توليد الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية...

عضويات الشبكية المتكاملة للخلايا الدبقية الصغيرة: نموذج لدراسة أمراض الشبكية

<ol>
	<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).</li><li>Zhang, X., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+induction+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (170), e62298 (2021).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages.">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+pu.1-+and+irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways.</a> Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>O'koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+function+is+distinct+in+different+anatomical+locations+during+retinal+homeostasis+and+degeneration.">Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration.</a> Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).</li><li>Margeta, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+E4+impairs+the+response+of+neurodegenerative+retinal+microglia+and+prevents+neuronal+loss+in+glaucoma.">Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma.</a> Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+innate+responses+in+microglia+derived+from+retinoblastoma+patient-specific+IPSCs.">Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs.</a> Glia. 72 (5), 872-884 (2024).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), eaal3222 (2017).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transcriptome+profiling,+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids.">transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li><li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+microglia+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+empower+retinal+organ.">Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ.</a> Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).</li><li>Zhang, X., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruct+human+retinoblastoma+in+vitro.">Reconstruct human retinoblastoma in vitro.</a> J Vis Exp. (188), e62629 (2022).</li><li>Park, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPS-cell-derived+microglia+promote+brain+organoid+maturation+via+cholesterol+transfer.">IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer.</a> Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).</li><li>Usui-Ouchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+human+ipsc-derived+macrophage+progenitors+into+retinal+organoids+to+generate+a+mature+retinal+microglial+niche.">Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche.</a> Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).</li><li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+microglia-like+cells+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids.">Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).</li></ol>

نظرا لمحدودية توافر شبكية العين البشرية ، فإن فهمنا الحالي للاستجابات الالتهابية للشبكية يأتي تقريبا من النماذج الحيوانية. للتغلب على هذا القيد ، تم تمييز عضويات الشبكية. كان تطوير نماذج الشبكية العضوية مجالا نشطا للبحث ، يهدف إلى تلخيص تعقيد شبكية العين البشرية لنمذجة المرض والتطوير ال...

كمصدر محدود لشبكية العين البشرية ، يمثل تمايز الخلايا الجذعية البشرية إلى عضويات شبكية ثلاثية الأبعاد (3D) نموذجا واعدا في المختبر لمحاكاة شبكية العين1. يحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا في شبكية العين ، بما في ذلك المستقبلات الضوئية وخلايا العقدة الشبكية والخلايا ثنائية القطب وخلايا مولر والخلايا الأفقية والخلايا النجمية2. يتيح هذا النموذج محاكاة ودراسة كل من آليات نمو الشبكية والتسبب في أمراض الشبكية. ومع ذلك ، بسبب طريقة التمايز الاتجاهي ، تم اشتقاق عضويات الشبكية من الأديم الظاهر العصبي3 ، والتي تفتقر إلى العديد من أنواع الخلايا الأخرى التي تنشأ من طبقات جرثومية مختلفة ، مثل الخلايا الدبقية الصغيرة من كيس الصفار والخلايا المحيطة بالأوعية الدموية من الأديم المتوسط4،5،6.
في الوقت الحاضر ، ثبت أن العديد من أمراض الشبكية ، مثل التهاب الشبكية الصباغي7 ، والزرق8 ، والورم الأرومي الشبكي9 ، ترتبط ارتباطا وثيقا بالخلايا الدبقية الصغيرة داخل شبكية العين. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود نماذج بحثية مناسبة ، لا تزال الآليات المحددة التي توضح العلاقة بين الخلايا الدبقية الصغيرة وهذه الأمراض غير واضحة. في حين أن الفئران كانت بمثابة نموذج مناسب لدراسة أمراض الشبكية ، فقد أبرزت الدراسات الحديثة اختلافات كبيرة بين الخلايا الدبقية الصغيرة للفأر والإنسان من حيث العمر ومعدل الانتشار وغياب الجينات البشريةالمتماثلة 10,11. أشارت هذه النتائج إلى أن الاستنتاجات المستخلصة من نماذج الفئران قد لا تكون موثوقة تماما ، مما يؤكد أهمية بناء عضويات شبكية العين البشرية التي تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة.
على مدى العقود القليلة الماضية ، تم تطوير طرق مختلفة للتمايز ثلاثي الأبعاد لعضويات الشبكية12,13. لتسهيل عملية الاستزراع المشترك للخلايا الدبقية الصغيرة داخل عضويات الشبكية ، اخترنا طريقة تمايز تتضمن الانتقال من ثقافة الالتصاق إلى ثقافة التعليق. يتيح هذا النهج بنجاح دمج الخلايا الدبقية الصغيرة في عضويات الشبكية ، والحفاظ عليها لمدة 60 يوما على الأقل14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acctuase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRX(M02)</td>
			<td>abnova</td>
			<td>H00001406-M02</td>
			<td>Antibody; dilution as per the manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IBA1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5076</td>
			<td>Antibody; dilution as per the manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (1U/mL)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C141905005BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biological Industry</td>
			<td>04-002-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7041-100G</td>
			<td>Solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 cell line</td>
			<td>WiCell Research Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-3</td>
			<td>RD Systems&#160;</td>
			<td>203-IL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-34</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-34-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSR</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>RD Systems&#160;</td>
			<td>216-MC-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem cell medium&#160;</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ViVO</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembling retinal organoids with microglia

نظرا لمحدودية الوصول إلى شبكية العين البشرية ، فإن عضويات الشبكية (ROs) هي أفضل نموذج لدراسة أمراض الشبكية البشرية ، والتي يمكن أن تكشف عن آلية تطور الشبكية وحدوث أمراض الشبكية. الخلايا الدبقية الصغيرة (MG) هي بلاعم مقيمة فريدة من نوعها في شبكية العين والجهاز العصبي المركزي (CNS) ، وتخدم وظائف المناعة الحاسمة. ومع ذلك ، تفتقر الكائنات العضوية في شبكية العين إلى الخلايا الدبقية الصغيرة لأن أصل تمايزها هو كيس الصفار. لا يزال التسبب المحدد للخلايا الدبقية الصغيرة في أمراض الشبكية هذه غير واضح. لذلك ، تبين أن إنشاء نموذج عضوي شبكي مدمج في الخلايا الدبقية الصغيرة أمر ضروري. هنا ، نجحنا في بناء نموذج مشترك من عضويات الشبكية مع الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية. في هذه المقالة ، قمنا بتمييز الخلايا الدبقية الصغيرة ثم شاركنا في الاستزراع إلى عضويات الشبكية في المرحلة المبكرة. كدمج للخلايا المناعية ، يوفر هذا النموذج منصة محسنة لنمذجة أمراض الشبكية وفحص الأدوية لتسهيل البحث المتعمق حول التسبب في أمراض الشبكية والجهاز العصبي المركزي وعلاجها.

As the limited source of the human retina, the differentiation of human stem cells into three-dimensional (3D) retinal organoids represents a promising in vitro model for simulating the retina1. It contains different cell types in the retina, including photoreceptors, retinal ganglion cells, bipolar cells, M&#252;ller cells, horizontal cells, and astrocytes2. This model enables the emulation and study of both retinal development mechanisms and the pathogenesis of retinal diseases. However, due to the directional differentiation method, retinal organoids were derived from the neuroectoderm3, lacking many other cell types originating from different germ layers, such as microglia from the yolk sac and perivascular cells from the mesoderm4,5,6.
At present, many retinal diseases, such as retinitis pigmentosa7, glaucoma8, and retinoblastoma9, have been proven to be closely related to microglia within the retina. However, due to the lack of proper research models, specific mechanisms illustrating the relationship between microglia and these diseases still remain unclear. While mice have served as a favorable model for studying retinal diseases, recent studies have highlighted significant differences between mouse and human microglia in terms of lifespan, proliferation rate, and the absence of human homologous genes10,11. These findings suggested that conclusions drawn from mouse models may not be entirely reliable, emphasizing the importance of constructing human retinal organoids containing microglia.
Over the past few decades, various methods for the 3D differentiation of retinal organoids have been developed12,13. To facilitate the co-culture operation of microglia within retinal organoids, we have selected a differentiation method involving a transition from adherent to suspension culture. This approach successfully enables microglia to be incorporated into the retinal organoids, maintaining them for at least 60 days14.

توليد الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية لدمجها مع عضويات الشبكية لتحسين نمذجة المرض

تجميع عضويات الشبكية مع الخلايا الدبقية الصغيرة

To begin, obtain the human embryonic stem cells in the stem cell medium with a cell density of 80 to 90%After removing the spent medium, rinse the cells in each well with one milliliter of 1X DPBS. Incubate the stem cell colonies in each well with one milliliter of 0.5 millimolar EDTA for approximately five minutes at 37 degrees Celsius. Check the colony morphology to confirm that the edges are slightly curled up with loose gaps.Aspirate the EDTA, and if necessary, incubate cells at 37 degrees Celsius for another one to two minutes, but not exceeding eight minutes. Gently rinse the cells in each well with six milliliters of medium A containing six microliters of 10 millimolar ROCK inhibitor Y-27632 solution. Gently tap the bottom of the dish to help rinse the cells.After 24 hours, observe the cells under the microscope to confirm the embryo body formation. Using a 10 milliliter pipette, collect the embryo bodies into a 15 milliliter centrifugal tube and wait for the embryo bodies to settle to the bottom for five minutes. Then carefully aspirate the supernatant and resuspend the embryo bodies in six milliliters of fresh medium A.Transfer them into a new low adhesion well of a six-well plate and culture in a 37 degrees Celsius incubator.On day four, coat a 10 centimeter dish with three milliliters of 0.1%fish gelatin solution and incubate for at least one hour in a 5%carbon dioxide, 37 degrees Celsius incubator. Then remove the gelatin solution and rinse the dish once with five to six milliliters of 1X DPBS. Carefully collect the embryo bodies into a 15 milliliter centrifugal tube and wait for the embryo bodies to settle to the bottom In five minutes.Gently resuspend the embryo bodies with 15 milliliters of medium B and transfer them to the coated 10 centimeter dish. Culture in a 37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide incubator for one week after 49 days. Centrifuge the cells at 200 x g for five minutes at room temperature.Carefully aspirate the supernatant and resuspend the cells with two milliliters of fresh medium C.Transfer into a new low adhesion well of a six-well plate. Incubate the plate in a 5%carbon dioxide, 37 degrees Celsius incubator. On day 56, replace the spent medium with two milliliters of medium C per well.Examine the plate under a microscope to identify the branched microglia adhere to the bottom of the low adhesion well. To harvest microglia for co-culturing, gently replace the medium C in each well with one milliliter Accutase and incubate at 37 degrees Celsius for three minutes. Using a five milliliter pipette, collect the microglia cells into a 15 milliliter tube and centrifuge the cells at 200 x g for five minutes at room temperature.After discarding the supernatant, suspend the microglia with one milliliter of medium E.

تم وصف الإجراء الخاص بتوليد عضويات الشبكية في دراستنا السابقة15. هنا ، نعرض النتائج التمثيلية للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الدبقية الصغيرة والعضوية الشبكية.
هنا ، نوضح كل مرحلة من مراحل تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل 1 أ). يمثل اليوم 0 ?...

الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا مناعية مقيمة فريدة في شبكية العين ، وتلعب أدوارا حاسمة في العديد من الأمراض التنكسية في شبكية العين. يمكن أن يؤدي إنشاء نموذج زراعة مشتركة لعضويات الشبكية مع الخلايا الدبقية الصغيرة إلى تسهيل فهم أفضل للتسبب في أمراض الشبكية والتقدم التنموي.

Due to the limited accessibility of the human retina, retinal organoids (ROs) are the best model for studying human retinal disease, which could reveal ...

تجميع عضويات الشبكية مع الخلايا الدبقية الصغيرة

Abstract