Langsigtet overvågning af iltforbrugshastigheder i stærkt differentierede og polariserede retinale pigmentepitelkulturer

Mitokondriemetabolisme er afgørende for den normale funktion af nethindens pigmentepitel (RPE), et monolag af celler i nethinden, der er vigtigt for fotoreceptoroverlevelse. RPE-mitokondriedysfunktion er et kendetegn for aldersrelateret makuladegeneration (AMD), den førende årsag til irreversibel blindhed i den udviklede verden, og proliferativ vitreoretinopati (PVR), en blændende komplikation af nethindeløsning. RPE-degenerative forhold er blevet velmodelleret af RPE-kultursystemer, der er stærkt differentierede og polariserede for at efterligne in vivo RPE. Det har imidlertid været vanskeligt at overvåge iltforbrugshastigheder (OCR), en proxy for mitokondriefunktion, i sådanne dyrkningssystemer, fordi de forhold, der fremmer ideel RPE-polarisering og differentiering, ikke tillader nemme OCR-målinger.

Her introducerer vi et nyt system, Resipher, til at overvåge OCR i uger ad gangen i veldifferentierede RPE-kulturer, samtidig med at RPE opretholdes på optimale vækstsubstrater og fysiologiske kulturmedier i en standard cellekulturinkubator. Dette system beregner OCR ved at måle iltkoncentrationsgradienten til stede i mediet over cellerne. Vi diskuterer fordelene ved dette system i forhold til andre metoder til detektering af OCR, og hvordan man opsætter systemet til måling af OCR i RPE-kulturer. Vi dækker vigtige tips og tricks til brug af systemet, forsigtighed med at fortolke dataene og retningslinjer for fejlfinding af uventede resultater.

Vi leverer også en online lommeregner til ekstrapolering af niveauet af hypoxi, normoxi eller hyperoxi RPE-kulturer baseret på iltgradienten i mediet over celler, der detekteres af systemet. Endelig gennemgår vi to anvendelser af systemet, der måler den metaboliske tilstand af RPE-celler i en PVR-model og forstår, hvordan RPE metabolisk tilpasser sig hypoxi. Vi forventer, at brugen af dette system på stærkt polariserede og differentierede RPE-kulturer vil forbedre vores forståelse af RPE-mitokondriemetabolisme både under fysiologiske og sygdomstilstande.