Langdurige monitoring van zuurstofverbruiken in sterk gedifferentieerde en gepolariseerde retinale pigmentepitheelculturen

Het mitochondriale metabolisme is van cruciaal belang voor de normale functie van het retinale pigmentepitheel (RPE), een monolaag van cellen in het netvlies die belangrijk is voor de overleving van fotoreceptoren. RPE mitochondriale disfunctie is een kenmerk van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de belangrijkste oorzaak van onomkeerbare blindheid in de ontwikkelde wereld, en proliferatieve vitreoretinopathie (PVR), een verblindende complicatie van netvliesloslatingen. RPE-degeneratieve aandoeningen zijn goed gemodelleerd door RPE-cultuursystemen die sterk gedifferentieerd en gepolariseerd zijn om in vivo RPE na te bootsen. Het monitoren van zuurstofverbruikssnelheden (OCR), een proxy voor de mitochondriale functie, was echter moeilijk in dergelijke kweeksystemen omdat de omstandigheden die ideale RPE-polarisatie en differentiatie bevorderen, geen gemakkelijke OCR-metingen mogelijk maken.

Hier introduceren we een nieuw systeem, Resipher, om OCR wekenlang te monitoren in goed gedifferentieerde RPE-culturen, terwijl de RPE op optimale groeisubstraten en fysiologische kweekmedia wordt gehandhaafd in een standaard celcultuurincubator. Dit systeem berekent OCR door de zuurstofconcentratiegradiënt te meten die aanwezig is in de media boven de cellen. We bespreken de voordelen van dit systeem ten opzichte van andere methoden voor het detecteren van OCR en hoe het systeem voor het meten van OCR in RPE-culturen kan worden opgezet. We behandelen belangrijke tips en trucs voor het gebruik van het systeem, voorzichtigheid bij het interpreteren van de gegevens en richtlijnen voor het oplossen van onverwachte resultaten.

We bieden ook een online rekenmachine voor het extrapoleren van het niveau van hypoxie, normoxie of hyperoxie RPE-culturen op basis van de zuurstofgradiënt in de media boven cellen die door het systeem worden gedetecteerd. Ten slotte bespreken we twee toepassingen van het systeem, het meten van de metabolische toestand van RPE-cellen in een PVR-model en het begrijpen hoe de RPE zich metabolisch aanpast aan hypoxie. We verwachten dat het gebruik van dit systeem op sterk gepolariseerde en gedifferentieerde RPE-culturen ons begrip van het mitochondriale metabolisme van RPE zal vergroten, zowel onder fysiologische als onder ziektetoestanden.