Monitoramento de longo prazo das taxas de consumo de oxigênio em culturas epiteliais pigmentares retinianas altamente diferenciadas e polarizadas

O metabolismo mitocondrial é crítico para a função normal do epitélio pigmentar da retina (EPR), uma monocamada de células na retina importante para a sobrevivência dos fotorreceptores. A disfunção mitocondrial do EPR é uma marca registrada da degeneração macular relacionada à idade (DMRI), a principal causa de cegueira irreversível no mundo desenvolvido, e da vitreorretinopatia proliferativa (RVP), uma complicação ofuscante dos descolamentos de retina. As condições degenerativas do EPR foram bem modeladas por sistemas de cultura de EPR que são altamente diferenciados e polarizados para mimetizar o EPR in vivo . No entanto, o monitoramento das taxas de consumo de oxigênio (OCR), um proxy para a função mitocondrial, tem sido difícil em tais sistemas de cultura porque as condições que promovem a polarização e diferenciação ideais do RPE não permitem medições fáceis de OCR.

Aqui, apresentamos um novo sistema, o Resipher, para monitorar o OCR por semanas a fio em culturas de EPR bem diferenciadas, mantendo o EPR em substratos de crescimento ideais e meios de cultura fisiológicos em uma incubadora de cultura de células padrão. Este sistema calcula o OCR medindo o gradiente de concentração de oxigênio presente no meio acima das células. Discutimos as vantagens deste sistema sobre outros métodos para detectar OCR e como configurar o sistema para medir OCR em culturas de EPR. Abordamos as principais dicas e truques para usar o sistema, cuidados sobre a interpretação dos dados e diretrizes para solucionar problemas de resultados inesperados.

Também fornecemos uma calculadora on-line para extrapolar o nível de hipóxia, normóxia ou hiperóxia que as culturas de EPR experimentam com base no gradiente de oxigênio no meio acima das células detectadas pelo sistema. Finalmente, revisamos duas aplicações do sistema, medindo o estado metabólico das células RPE em um modelo PVR e entendendo como o RPE se adapta metabolicamente à hipóxia. Prevemos que o uso deste sistema em culturas de EPR altamente polarizadas e diferenciadas aumentará nossa compreensão do metabolismo mitocondrial de EPR, tanto em estados fisiológicos quanto em estados de doença.