Långtidsövervakning av syreförbrukningshastigheter i mycket differentierade och polariserade retinala pigmentepitelkulturer

Mitokondriell metabolism är avgörande för den normala funktionen av retinalt pigmentepitel (RPE), ett monolager av celler i näthinnan som är viktigt för fotoreceptorns överlevnad. RPE mitokondriell dysfunktion är ett kännetecken för åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), den främsta orsaken till irreversibel blindhet i den utvecklade världen, och proliferativ vitreoretinopati (PVR), en blindande komplikation av näthinneavlossning. RPE-degenerativa förhållanden har modellerats väl av RPE-odlingssystem som är mycket differentierade och polariserade för att efterlikna RPE in vivo . Det har dock varit svårt att övervaka syreförbrukningshastigheter (OCR), en proxy för mitokondriell funktion, i sådana odlingssystem eftersom de förhållanden som främjar idealisk RPE-polarisering och differentiering inte tillåter enkla OCR-mätningar.

Här introducerar vi ett nytt system, Resipher, för att övervaka OCR i veckor i taget i väldifferentierade RPE-kulturer samtidigt som RPE bibehålls på optimala tillväxtsubstrat och fysiologiska odlingsmedier i en vanlig cellodlingsinkubator. Detta system beräknar OCR genom att mäta syrekoncentrationsgradienten som finns i mediet ovanför cellerna. Vi diskuterar fördelarna med detta system jämfört med andra metoder för att detektera OCR och hur man sätter upp systemet för att mäta OCR i RPE-kulturer. Vi går igenom viktiga tips och tricks för att använda systemet, försiktighet när det gäller att tolka data och riktlinjer för felsökning av oväntade resultat.

Vi tillhandahåller också en online-kalkylator för att extrapolera nivån av hypoxi, normoxia eller hyperoxia RPE-kulturer baserat på syregradienten i mediet ovanför celler som detekteras av systemet. Slutligen granskar vi två tillämpningar av systemet, där vi mäter det metaboliska tillståndet hos RPE-celler i en PVR-modell och förstår hur RPE metaboliskt anpassar sig till hypoxi. Vi förväntar oss att användningen av detta system på mycket polariserade och differentierade RPE-kulturer kommer att öka vår förståelse för RPE-mitokondriell metabolism både under fysiologiska och sjukdomstillstånd.