אבלציה של תאי לייזר בזחלי דרוזופילה שלמים חושפת תחרות סינפטית

Summary

פרוטוקול זה מדגים אבלציה של תאי לייזר של נוירונים בודדים בזחלי דרוזופילה שלמים. השיטה מאפשרת לחקור את ההשפעה של הפחתת התחרות בין תאי עצב במערכת העצבים המתפתחת.

Abstract

הפרוטוקול מתאר אבלציה של נוירון יחיד עם מערכת לייזר של 2 פוטונים במערכת העצבים המרכזית (CNS) של זחלי Drosophila melanogaster שלמים. באמצעות שיטה לא פולשנית זו, ניתן לתפעל את מערכת העצבים המתפתחת באופן ספציפי לתא. שיבוש ההתפתחות של נוירונים בודדים ברשת יכול לשמש כדי לחקור כיצד מערכת העצבים יכולה לפצות על אובדן קלט סינפטי. תאי עצב בודדים הופעלו באופן ספציפי במערכת הסיבים הענקית של דרוזופילה, תוך התמקדות בשני נוירונים: סיב הענק הפרה-סינפטי (GF) והנוירון המוטורי הטרגוטרוצנטרלי הפוסט-סינפטי (TTMn). סינפסות ה-GF עם ה-TTMn האיפסילטרלי, שהוא חיוני לתגובת הבריחה. אבלציה של אחד ה-GFs במוח הכוכב^השלישי , מיד לאחר שה-GF מתחיל בצמיחה אקסונלית, מסירה לצמיתות את התא במהלך התפתחות מערכת העצבים המרכזית. ה-GF הנותר מגיב לשכן הנעדר ויוצר מסוף סינפטי חוץ רחמי ל-TTMn הנגדי. מסוף לא טיפוסי זה, סימטרי דו-צדדי, מעצבב את שני ה-TTMns, כפי שמודגם על-ידי צימוד צבעים, ומניע את שני תאי העצב המוטוריים, כפי שמודגם בבדיקות אלקטרופיזיולוגיות. לסיכום, אבלציה של נוירון יחיד מדגימה תחרות סינפטית בין זוג נוירונים דו-צדדיים שיכולים לפצות על אובדן של נוירון אחד ולהחזיר תגובות נורמליות למעגל המילוט.

Introduction

אבלציה בלייזר היא כלי מועדף לניתוח מעגלים עצביים במגוון רחב של אורגניזמים. הוא פותח במערכות גנטיות כמו תולעים וזבובים, והוא יושם ברחבי ממלכת החי כדי לחקור את המבנה, התפקוד וההתפתחות של מערכת העצבים ^1,2,3. כאן, אבלציה של נוירון יחיד שימשה כדי לחקור כיצד נוירונים מתקשרים במהלך הרכבת מעגלים בדרוזופילה. מערכת המילוט של הזבוב היא מעגל מועדף לניתוח מכיוון שהיא מכילה את הנוירונים הגדולים ביותר ואת הסינפסות הגדולות ביותר בזבוב הבוגר, והמעגל אופיין היטב בעשורים האחרונים⁴. התפקיד שממלאות אינטראקציות נוירון-נוירון בהרכבת מעגל הסיבים הענק הוא מוקד המחקר ה....

Protocol

כל בעלי החיים ששימשו לפרוטוקול היו מהמין Drosophila melanogaster. אין בעיות אתיות סביב השימוש במין זה. לא היה צורך באישור אתי כדי לבצע עבודה זו. הפרטים של מיני הדרוזופילה , ריאגנטים וציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. גידול דרוזופילה ובחירת שלב הזחל ה.......

Discussion

אבלציה של תאים במיקרוסקופ של 2 פוטונים הוכחה כשיטה מוצלחת ביותר למניפולציה של התפתחות מעגלים עצביים בדרוזופילה. מכיוון ששיטה זו אינה פולשנית, היא גורמת נזק מינימלי לחיה. הנתונים תומכים בתועלת של מניפולציה ספציפית לתא זה של מעגלים ידועים.

קריטי להצלחת האבלציה היה בחירת.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jaxkson ImmunoResearch	111-545-003
Anti-green fluorescent protein, rabbit	Fisher Scientific	A11122	1:500 concentration
Apo LWD 25x/1.10W Objective	Nikon	MRD77220	water immersion long working distance
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser	Coherent
Cotton Ball	Genesee Scientific	51-101
Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby)	Fisher Scientific	D1817
Drosophila saline			recipe from Gu and O'Dowd, 2006
Ethyl Ether	Fisher Scientific	E134-1	Danger, Flammable liquid
Fly food B (Bloomington recipe)	LabExpress	7001-NV
Methyl salicylate	Fisher Scientific	O3695-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Eppendorf	22363204
Microscope cover-slip 18x18 #1.5	Fisher Scientific	12-541A
Neurobiotin Tracer	Vector Laboratories	SP-1120
Nikon A1R multi-photon microscope	Nikon		on an upright FN1 microsope stand
NIS Elements Advanced Research	Nikon		Acquisition and data analysis software
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	T353-500
PBS (Phosphate Buffered Salin)	Fisher BioReagents	BP2944-100	Tablets
R91H05-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	40594
shakB(lethal)-GAl4	Bloomington Drosophila Stock Center	51633
Superfrost microscope glass slide	Fisher Scientific	12-550-143
Triton X-100	Fisher Scientific	422355000	detergent solution
UAS-10xGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	32185