Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מדגים אבלציה של תאי לייזר של נוירונים בודדים בזחלי דרוזופילה שלמים. השיטה מאפשרת לחקור את ההשפעה של הפחתת התחרות בין תאי עצב במערכת העצבים המתפתחת.

Abstract

הפרוטוקול מתאר אבלציה של נוירון יחיד עם מערכת לייזר של 2 פוטונים במערכת העצבים המרכזית (CNS) של זחלי Drosophila melanogaster שלמים. באמצעות שיטה לא פולשנית זו, ניתן לתפעל את מערכת העצבים המתפתחת באופן ספציפי לתא. שיבוש ההתפתחות של נוירונים בודדים ברשת יכול לשמש כדי לחקור כיצד מערכת העצבים יכולה לפצות על אובדן קלט סינפטי. תאי עצב בודדים הופעלו באופן ספציפי במערכת הסיבים הענקית של דרוזופילה, תוך התמקדות בשני נוירונים: סיב הענק הפרה-סינפטי (GF) והנוירון המוטורי הטרגוטרוצנטרלי הפוסט-סינפטי (TTMn). סינפסות ה-GF עם ה-TTMn האיפסילטרלי, שהוא חיוני לתגובת הבריחה. אבלציה של אחד ה-GFs במוח הכוכבהשלישי , מיד לאחר שה-GF מתחיל בצמיחה אקסונלית, מסירה לצמיתות את התא במהלך התפתחות מערכת העצבים המרכזית. ה-GF הנותר מגיב לשכן הנעדר ויוצר מסוף סינפטי חוץ רחמי ל-TTMn הנגדי. מסוף לא טיפוסי זה, סימטרי דו-צדדי, מעצבב את שני ה-TTMns, כפי שמודגם על-ידי צימוד צבעים, ומניע את שני תאי העצב המוטוריים, כפי שמודגם בבדיקות אלקטרופיזיולוגיות. לסיכום, אבלציה של נוירון יחיד מדגימה תחרות סינפטית בין זוג נוירונים דו-צדדיים שיכולים לפצות על אובדן של נוירון אחד ולהחזיר תגובות נורמליות למעגל המילוט.

Introduction

אבלציה בלייזר היא כלי מועדף לניתוח מעגלים עצביים במגוון רחב של אורגניזמים. הוא פותח במערכות גנטיות כמו תולעים וזבובים, והוא יושם ברחבי ממלכת החי כדי לחקור את המבנה, התפקוד וההתפתחות של מערכת העצבים 1,2,3. כאן, אבלציה של נוירון יחיד שימשה כדי לחקור כיצד נוירונים מתקשרים במהלך הרכבת מעגלים בדרוזופילה. מערכת המילוט של הזבוב היא מעגל מועדף לניתוח מכיוון שהיא מכילה את הנוירונים הגדולים ביותר ואת הסינפסות הגדולות ביותר בזבוב הבוגר, והמעגל אופיין היטב בעשורים האחרונים4. התפקיד שממלאות אינטראקציות נוירון-נוירון בהרכבת מעגל הסיבים הענק הוא מוקד המחקר ה....

Protocol

כל בעלי החיים ששימשו לפרוטוקול היו מהמין Drosophila melanogaster. אין בעיות אתיות סביב השימוש במין זה. לא היה צורך באישור אתי כדי לבצע עבודה זו. הפרטים של מיני הדרוזופילה , ריאגנטים וציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. גידול דרוזופילה ובחירת שלב הזחל ה.......

Representative Results

שיטה זו יכולה לשמש כדי לתפעל את הפיתוח של רשתות עצביות ספציפיות במערכת העצבים של Drosophila. שאלת המחקר העיקרית כאן הייתה היווצרות קשרים סינפטיים. הסרת ה-GF הפרה-סינפטי או ה-TTMn הבתר-סינפטי אפשרה לחקור סינפטוגנזה תגובתית בסינפסה מרכזית זו ובמנגנונים המולקולריים החיוניים לתפקוד ולהתפתחות ה?.......

Discussion

אבלציה של תאים במיקרוסקופ של 2 פוטונים הוכחה כשיטה מוצלחת ביותר למניפולציה של התפתחות מעגלים עצביים בדרוזופילה. מכיוון ששיטה זו אינה פולשנית, היא גורמת נזק מינימלי לחיה. הנתונים תומכים בתועלת של מניפולציה ספציפית לתא זה של מעגלים ידועים.

קריטי להצלחת האבלציה היה בחירת.......

Acknowledgements

ניסויים במיקרוסקופ בעל 2 פוטונים בוצעו בליבת דימות התא המתקדמת של מכון המוח FAU סטיילס-ניקולסון. ברצוננו להודות ליוזמת יופיטר למדעי החיים על התמיכה הכספית.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jaxkson ImmunoResearch111-545-003
Anti-green fluorescent protein, rabbitFisher ScientificA111221:500 concentration
Apo LWD 25x/1.10W ObjectiveNikonMRD77220water immersion long working distance
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaB4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II LaserCoherent
Cotton BallGenesee Scientific51-101
Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby)Fisher ScientificD1817
Drosophila salinerecipe from Gu and O'Dowd, 2006
Ethyl EtherFisher ScientificE134-1Danger, Flammable liquid
Fly food B (Bloomington recipe)LabExpress7001-NV
Methyl salicylateFisher ScientificO3695-500
Microcentrifuge tube 1.5 mLEppendorf22363204
Microscope cover-slip 18x18 #1.5Fisher Scientific12-541A
Neurobiotin TracerVector LaboratoriesSP-1120
Nikon A1R multi-photon microscopeNikonon an upright FN1 microsope stand
NIS Elements Advanced ResearchNikonAcquisition and data analysis software
Paraformaldehyde (PFA)Fisher ScientificT353-500
PBS (Phosphate Buffered Salin)Fisher BioReagentsBP2944-100Tablets
R91H05-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center40594
shakB(lethal)-GAl4Bloomington Drosophila Stock Center51633
Superfrost microscope glass slideFisher Scientific12-550-143
Triton X-100Fisher Scientific422355000detergent solution
UAS-10xGFPBloomington Drosophila Stock Center32185

References

  1. Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
  2. Bower, D. V., et al. A....

Explore More Articles

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved