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Este protocolo demonstra a ablação de células a laser de neurônios individuais em larvas intactas de Drosophila . O método permite o estudo do efeito da redução da competição entre neurônios no sistema nervoso em desenvolvimento.
O protocolo descreve a ablação de um único neurônio com um sistema de laser de 2 fótons no sistema nervoso central (SNC) de larvas intactas de Drosophila melanogaster . Usando este método não invasivo, o sistema nervoso em desenvolvimento pode ser manipulado de maneira específica da célula. Interromper o desenvolvimento de neurônios individuais em uma rede pode ser usado para estudar como o sistema nervoso pode compensar a perda de entrada sináptica. Os neurônios individuais foram especificamente ablacionados no sistema de fibras gigantes de Drosophila, com foco em dois neurônios: a fibra gigante pré-sináptica (GF) e o neurônio motor tergotrochanteral pós-sináptico (TTMn). O GF faz sinapses com o TTMn ipsilateral, que é crucial para a resposta de escape. A ablação de um dos GFs no cérebro de3º ínstar, logo após o GF iniciar o crescimento axonal, remove permanentemente a célula durante o desenvolvimento do SNC. O GF restante reage ao vizinho ausente e forma um terminal sináptico ectópico para o TTMn contralateral. Este terminal atípico e bilateralmente simétrico inerva ambos os TTMns, como demonstrado pelo acoplamento de corante, e aciona ambos os neurônios motores, conforme demonstrado por ensaios eletrofisiológicos. Em resumo, a ablação de um único interneurônio demonstra competição sináptica entre um par bilateral de neurônios que pode compensar a perda de um neurônio e restaurar as respostas normais ao circuito de escape.
A ablação a laser é uma ferramenta preferida para dissecar circuitos neurais em uma ampla variedade de organismos. Desenvolvido em sistemas genéticos modelo, como vermes e moscas, tem sido aplicado em todo o reino animal para estudar a estrutura, função e desenvolvimento do sistema nervoso 1,2,3. Aqui, a ablação de neurônio único foi empregada para investigar como os neurônios interagem durante a montagem do circuito em Drosophila. O sistema de escape da mosca é um circuito favorito para análise porque contém os maiores neurônios e as maiores sinapses da mosca adulta....
Todos os animais utilizados para o protocolo foram da espécie Drosophila melanogaster. Não há questões éticas em torno do uso desta espécie. A autorização ética não foi necessária para realizar este trabalho. Os detalhes das espécies, reagentes e equipamentos de Drosophila usados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Criação de Drosophila e seleção do estágio larval correto
Este método pode ser usado para manipular o desenvolvimento de redes neuronais específicas no sistema nervoso de Drosophila. A principal questão de pesquisa aqui foi a formação de conexões sinápticas. A remoção do GF pré-sináptico ou do TTMn pós-sináptico permitiu a investigação da sinaptogênese reativa nesta sinapse central e os mecanismos moleculares cruciais para a função e o desenvolvimento sináptico. Conforme descrito no protocolo, foi realizada a ablação de células a laser de um dos G.......
A ablação celular com um microscópio de 2 fótons provou ser um método altamente bem-sucedido para manipular o desenvolvimento do circuito neuronal em Drosophila. Como esse método não é invasivo, causa danos mínimos ao animal. Os dados apóiam a utilidade dessa manipulação específica de células de circuitos conhecidos.
Crucial para o sucesso da ablação foi selecionar o driver Gal4 mais apropriado. Como o GFS é bem estudado, muitas linhas específicas de driver Gal4 fora.......
Experimentos no microscópio de 2 fótons foram realizados no Núcleo de Imagem Celular Avançada do Instituto do Cérebro Stiles-Nicholson da FAU. Gostaríamos de agradecer à Jupiter Life Science Initiative pelo apoio financeiro.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
Anti-green fluorescent protein, rabbit | Fisher Scientific | A11122 | 1:500 concentration |
Apo LWD 25x/1.10W Objective | Nikon | MRD77220 | water immersion long working distance |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B4287-25G | |
Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser | Coherent | ||
Cotton Ball | Genesee Scientific | 51-101 | |
Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby) | Fisher Scientific | D1817 | |
Drosophila saline | recipe from Gu and O'Dowd, 2006 | ||
Ethyl Ether | Fisher Scientific | E134-1 | Danger, Flammable liquid |
Fly food B (Bloomington recipe) | LabExpress | 7001-NV | |
Methyl salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | |
Microcentrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
Microscope cover-slip 18x18 #1.5 | Fisher Scientific | 12-541A | |
Neurobiotin Tracer | Vector Laboratories | SP-1120 | |
Nikon A1R multi-photon microscope | Nikon | on an upright FN1 microsope stand | |
NIS Elements Advanced Research | Nikon | Acquisition and data analysis software | |
Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | T353-500 | |
PBS (Phosphate Buffered Salin) | Fisher BioReagents | BP2944-100 | Tablets |
R91H05-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 40594 | |
shakB(lethal)-GAl4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51633 | |
Superfrost microscope glass slide | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | 422355000 | detergent solution |
UAS-10xGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 32185 |
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