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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo demonstra a ablação de células a laser de neurônios individuais em larvas intactas de Drosophila . O método permite o estudo do efeito da redução da competição entre neurônios no sistema nervoso em desenvolvimento.

Abstract

O protocolo descreve a ablação de um único neurônio com um sistema de laser de 2 fótons no sistema nervoso central (SNC) de larvas intactas de Drosophila melanogaster . Usando este método não invasivo, o sistema nervoso em desenvolvimento pode ser manipulado de maneira específica da célula. Interromper o desenvolvimento de neurônios individuais em uma rede pode ser usado para estudar como o sistema nervoso pode compensar a perda de entrada sináptica. Os neurônios individuais foram especificamente ablacionados no sistema de fibras gigantes de Drosophila, com foco em dois neurônios: a fibra gigante pré-sináptica (GF) e o neurônio motor tergotrochanteral pós-sináptico (TTMn). O GF faz sinapses com o TTMn ipsilateral, que é crucial para a resposta de escape. A ablação de um dos GFs no cérebro de ínstar, logo após o GF iniciar o crescimento axonal, remove permanentemente a célula durante o desenvolvimento do SNC. O GF restante reage ao vizinho ausente e forma um terminal sináptico ectópico para o TTMn contralateral. Este terminal atípico e bilateralmente simétrico inerva ambos os TTMns, como demonstrado pelo acoplamento de corante, e aciona ambos os neurônios motores, conforme demonstrado por ensaios eletrofisiológicos. Em resumo, a ablação de um único interneurônio demonstra competição sináptica entre um par bilateral de neurônios que pode compensar a perda de um neurônio e restaurar as respostas normais ao circuito de escape.

Introduction

A ablação a laser é uma ferramenta preferida para dissecar circuitos neurais em uma ampla variedade de organismos. Desenvolvido em sistemas genéticos modelo, como vermes e moscas, tem sido aplicado em todo o reino animal para estudar a estrutura, função e desenvolvimento do sistema nervoso 1,2,3. Aqui, a ablação de neurônio único foi empregada para investigar como os neurônios interagem durante a montagem do circuito em Drosophila. O sistema de escape da mosca é um circuito favorito para análise porque contém os maiores neurônios e as maiores sinapses da mosca adulta....

Protocol

Todos os animais utilizados para o protocolo foram da espécie Drosophila melanogaster. Não há questões éticas em torno do uso desta espécie. A autorização ética não foi necessária para realizar este trabalho. Os detalhes das espécies, reagentes e equipamentos de Drosophila usados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Criação de Drosophila e seleção do estágio larval correto

  1. Escolha uma linha .......

Representative Results

Este método pode ser usado para manipular o desenvolvimento de redes neuronais específicas no sistema nervoso de Drosophila. A principal questão de pesquisa aqui foi a formação de conexões sinápticas. A remoção do GF pré-sináptico ou do TTMn pós-sináptico permitiu a investigação da sinaptogênese reativa nesta sinapse central e os mecanismos moleculares cruciais para a função e o desenvolvimento sináptico. Conforme descrito no protocolo, foi realizada a ablação de células a laser de um dos G.......

Discussion

A ablação celular com um microscópio de 2 fótons provou ser um método altamente bem-sucedido para manipular o desenvolvimento do circuito neuronal em Drosophila. Como esse método não é invasivo, causa danos mínimos ao animal. Os dados apóiam a utilidade dessa manipulação específica de células de circuitos conhecidos.

Crucial para o sucesso da ablação foi selecionar o driver Gal4 mais apropriado. Como o GFS é bem estudado, muitas linhas específicas de driver Gal4 fora.......

Acknowledgements

Experimentos no microscópio de 2 fótons foram realizados no Núcleo de Imagem Celular Avançada do Instituto do Cérebro Stiles-Nicholson da FAU. Gostaríamos de agradecer à Jupiter Life Science Initiative pelo apoio financeiro.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jaxkson ImmunoResearch111-545-003
Anti-green fluorescent protein, rabbitFisher ScientificA111221:500 concentration
Apo LWD 25x/1.10W ObjectiveNikonMRD77220water immersion long working distance
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaB4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II LaserCoherent
Cotton BallGenesee Scientific51-101
Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby)Fisher ScientificD1817
Drosophila salinerecipe from Gu and O'Dowd, 2006
Ethyl EtherFisher ScientificE134-1Danger, Flammable liquid
Fly food B (Bloomington recipe)LabExpress7001-NV
Methyl salicylateFisher ScientificO3695-500
Microcentrifuge tube 1.5 mLEppendorf22363204
Microscope cover-slip 18x18 #1.5Fisher Scientific12-541A
Neurobiotin TracerVector LaboratoriesSP-1120
Nikon A1R multi-photon microscopeNikonon an upright FN1 microsope stand
NIS Elements Advanced ResearchNikonAcquisition and data analysis software
Paraformaldehyde (PFA)Fisher ScientificT353-500
PBS (Phosphate Buffered Salin)Fisher BioReagentsBP2944-100Tablets
R91H05-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center40594
shakB(lethal)-GAl4Bloomington Drosophila Stock Center51633
Superfrost microscope glass slideFisher Scientific12-550-143
Triton X-100Fisher Scientific422355000detergent solution
UAS-10xGFPBloomington Drosophila Stock Center32185

References

  1. Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
  2. Bower, D. V., et al. A....

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