이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 32371151), 광둥고등혁신연구소(Guangdong High Level Innovation Research Institute, 2021B0909050004), 홍콩연구보조금위원회(Hong Kong Research Grants Council) 협업연구기금(C5053-22GF), 일반연구기금(General Research Fund, 15224323 및 15104520), 홍콩혁신기술기금(Hong Kong Innovation Technology Fund, MHP/014/19), 홍콩폴리테크닉 대학교(Hong Kong Polytechnic University, G-SACD 및 1-CDJM)의 내부 자금 지원으로 부분적으로 지원된다. 랴오닝성 자연과학재단 - 국가로봇중점연구소 공동공개기금(2022-KF-22-03). 저자들은 홍콩 폴리테크닉 대학교(Hong Kong Polytechnic University)의 ULS(University Research Facility in Life Sciences)와 UBSN(University Research Facility in Behavioral and Systems Neuroscience)의 시설 및 기술 지원에 감사를 표합니다.

모든 절차와 동물 취급은 NSFC 윤리 지침과 Guangdong Institute of Intelligence Science and Technology의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인된 프로토콜 요구 사항을 준수했습니다.
1. 변환기 준비
<ol><li>내경이 3mm, 외경이 7mm, 중심 주파수가 500kHz인 압전판을 준비합니다. 참고: 외경은 대상이 되는 특정 뇌 영역에 따라 조정할 수 있으며 자극 정확도를 유지하면서 마우스 두개골의 경계를 초과하지 않으면서 최대화해야 합니다.</li>
	<li>에폭시는 페이스트를 사용하여 압전판의 양면에 와이어를 부착합니다(그림 1). 에폭시은 페이스트가 응고된 후 멀티미터를 사용하여 와이어 양쪽 끝의 저항을 측정하여 약 0이 되도록 합니다.</li>
	<li>깨끗한 유리 시트 표면에 양면 테이프 층을 바릅니다. 높이 8mm, 외경 8mm, 내경 7.6mm의 압전판과 구리 링을 유리판에 단단히 부착합니다. 알림: 구리 링의 내경은 압전판의 크기에 따라 결정되어 판이 구리 링으로 덮여 있는지 확인합니다.</li>
	<li>외경이 3mm인 폴리프로필렌 파이프를 압전판 중앙에 단단히 삽입하고 유리 시트에 단단히 부착합니다(그림 1).</li>
	<li>적당량의 에폭시 수지 접착제를 준비하고 진공 청소기로 청소합니다. 일회용 주사기를 사용하여 에폭시를 추출하고 구리 링에 천천히 주입합니다. 에폭시가 응고될 때까지 약 10시간 동안 기다립니다(그림 1).</li>
	<li>전자 납땜 인두를 사용하여 두 와이어의 느슨한 끝을 총검 너트 커넥터에 납땜합니다. 유리판을 제거합니다. 알코올로 변환기 표면을 청소합니다(그림 1).</li>
</ol>2. FUN에 대한 보고 매개변수
<ol><li>수중 청음기와 변환기를 탈이온수로 채워진 물 탱크에 넣습니다(그림 2A). 포지셔닝 시스템의 중앙 빔(Z축)이 변환기 축과 정렬되어 있는지 확인합니다. 이러한 정렬은 먼저 2D 스캐닝을 통해 초점면에서 최대 시야를 발견함으로써 달성할 수 있습니다. 둘째, 명확한 최대값을 가진 다른 평면에서 필드 최대값을 식별하는 단계; 셋째, 두 최대값의 X 및 Y 좌표를 비교한 다음 필요한 경우 변환기의 위치 및/또는 방향을 반복적으로 조정하는 단계28.</li>
	<li>수중 청음기의 끝을 변환기 표면과 1mm 거리에서 조정하고 이 거리를 일정하게 유지하면서 수중 청음기를 변환기의 오른쪽 가장자리 중앙에 배치합니다. 스캐닝 프로그램을 시작하여 XZ 평면의 자유 음장을 캡처합니다(그림 2B). 알림: 수중 청음기의 구성 방법은 https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control 에서 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>Z축을 따라 수중 청음기를 이동하여 공간 피크 압력과 연관된 깊이를 확인합니다. 이 실험에서 공간 피크 압력은 변환기 표면에서 3.4mm 거리에서 나타납니다. XY 평면에서 변환기의 오른쪽 하단 모서리로 수중 청음기를 이동할 때 이 거리를 유지하십시오. 전원을 켜고 스캐닝 프로그램을 시작하여 XY 평면의 자유 음장을 캡처합니다(그림 2B).</li>
	<li>4단계에서 설명한 대로 수술을 받은 쥐의 두개골에 변환기를 놓습니다. 2.1-2.3에 설명된 대로 수중 청음기 스캐닝을 통해 XZ 평면 및 XY 평면(그림 2D)에서 경두개 음향장을 획득합니다.</li>
	<li>free acoustic field와 transcranial acoustic field의 공간 피크 영역인 초점에서 압력 진폭을 읽습니다. 자유 음향 필드의 초점에서 압력 진폭은 730k Pa이고 경두개 음향 필드에서는 580k Pa입니다. -3dB(그림 2C,E)에서 초점 치수와 경두개 음장 내 XY 및 XZ 평면의 위치를 판독하여 이 변환기의 음각장이 대상 뇌 영역을 커버할 수 있는지 여부를 평가합니다.</li>
	<li>캐비테이션을 완화하기 위해 FDA 지침 문서에 의해 1.9 미만으로 제한되는 기계 지수(MI)를 계산합니다. MI의 계산은 다음 방정식으로 제공됩니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) 여기서 pr,.3 은 감쇠 계수 0.3dB cm-1 MHz-1로 조정된 MPa 단위의 피크 희박 압력을 나타내고 f0 는 작동 주파수(MHz)입니다. 측정된 경두개장 피크 희박 압력은 580kPa, 변환기에서 3.4mm, f0 는 500kHz이므로 감소된 pr,.3 은 576.6kPa입니다. MI는 0.82입니다.</li>
	<li>FDA 지침 문서에 따라 평면 방향으로 190W/cm2 미만이어야 하는 공간 피크 펄스 평균 강도(Isppa)를 계산합니다. 강도 계산은 다음 방정식으로 제공됩니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq02.jpg" style="margin: auto;">(2) 여기서 psp (t)는 공간 피크 위치에서 시간에 따라 변하는 음향 압력이고, Z 는 매체의 특성 음향 임피던스입니다(약 1.연조직의 경우 5 x 106 Rayls), PD는 펄스 지속 시간입니다. 정사각형 엔벨로프의 경우 이는 다음 방정식으로 줄어듭니다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq03.jpg" style="margin: auto;">(3) 여기서 A는 공간 피크 압력 진폭입니다. 초음파 초점 위치에서 측정된 A는 580kPa이고 뇌의 Z는 약 1.58 x 106 Rayls이므로 정사각형 외피의 Isppa 는 10.65 W/cm2 이고 정현파 외피의 Isppa 는 10.65 W/cm2입니다.</li>
	<li>평면 방향에서 430mW/cm2 미만으로 FDA 지침 문서에 의해 제한되는 공간 피크 시간 평균 강도(Ispta)를 계산합니다. 강도 계산은 다음 방정식으로 제공됩니다. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq04.jpg" style="margin: auto;">(4) 여기서 T는 평균이 계산되는 기간입니다. 정사각형 엔벨로프의 경우 이는 다음 방정식으로 줄어듭니다. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq05.jpg" style="margin: auto;">(5) 여기서 DC펄스 트레인은 펄스의 듀티 사이클입니다. 여기서 DC 펄스 트레인은 연속파가 사용되었기 때문에 1%이므로 Ispta는 정사각형 엔벨로프에 대한 공간 피크 펄스 평균 강도(106.5mW/cm2 )와 같습니다. MI, Isppa 및 Ispta 는 소프트웨어를 사용하여 계산할 수 있습니다(그림 3A). 쉽게 사용할 수 있는 MATLAB 기반 코드는 https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation 에서 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>Amax, 펄스 지속 시간, 펄스 반복 간격, 펄스 트레인 지속 시간 및 엔벨로프를 포함한 펄스 타이밍 매개변수를 보고합니다(그림 3B).</li>
</ol>3. 수술을 위한 동물 준비
<ol><li>약 20g의 대략적인 무게를 가진 8주 된 수컷 GCaMP6s 형질전환 마우스의 무게를 측정합니다. 멸균 식염수에 10mg/mL의 케타민과 2mg/mL의 자일라진을 함유한 용액을 준비합니다. 26G 바늘과 1mL 일회용 주사기를 사용하여 100mg/kg 케타민 및 20mg/kg 자일라진의 용량으로 복강 내 주사로 케타민/자일라진 용액을 투여합니다. 동물이 발가락 꼬집음과 같은 고통스러운 자극에 반응하지 않으면 수술 준비를 시작하십시오.</li>
	<li>수술 전에 페이더를 사용하여 동물의 머리털을 다듬고 70% 에탄올과 포비돈-요오드로 해당 부위를 소독합니다.</li>
	<li>마우스를 입체 프레임의 엎드린 위치에 놓고 두개골이 수평인지 확인합니다. 수분을 유지하기 위해 동물의 눈에 보호용 안과 연고를 바르십시오.</li>
</ol>4. 수술 절차
<ol><li>후두골에서 시작하여 비뼈의 시작 부분까지 시상 봉합사를 따라 절개합니다. 수술용 가위를 사용하여 양쪽 반구를 덮고 있는 피부를 제거합니다.</li>
	<li>멸균 식염수를 사용하여 두개골을 청소하고 남아 있는 골막을 제거합니다.</li>
	<li>면봉을 사용하여 노출된 두개골에 약 2초-3초 동안 3% 과산화수소를 적용하여 미세 기공을 만듭니다. 멸균 식염수로 철저히 헹구고 해당 부위가 완전히 건조되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>브레그마와 람다에 정렬된 입체학적 아틀라스에 의해 결정된 뇌 영역 위치 위의 멸균 오토클레이브 드릴 비트를 사용하여 0.6mm 직경의 버 구멍 개두술을 만듭니다. 멸균 식염수로 이물질을 씻어내고 철저한 건조를 보장합니다. 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>광섬유 페룰(임플란트)을 프로브 홀더에 삽입하고 입체 암 암에 연결합니다.</li>
	<li>stereotaxic arm을 사용하여 관심 영역 바로 위에 임플란트를 정렬합니다. 광섬유를 뇌 조직에 삽입할 때 약 2mm/min의 속도로 광섬유를 천천히 전진시킵니다.</li>
	<li>치과용 시멘트를 혼합하여 두개골 전체에 쉽게 적용할 수 있는 점도를 얻습니다. 멸균 이쑤시개를 사용하여 두개골 위와 임플란트의 아래쪽 부분에 치과용 시멘트의 얇은 층을 펴 바릅니다. 완전히 말리십시오.</li>
	<li>프로브 홀더를 조심스럽게 분리하십시오. 높이 3mm, 외경 3mm, 내경 2.6mm의 폴리프로필렌 파이프를 준비한 후 파이프 전체를 절단합니다.</li>
	<li>핀셋을 사용하여 파이프를 임플란트 바닥에 부착합니다. 치과용 시멘트 분말을 파이프에 붓고 광섬유 신호를 기록하기 위해 임플란트 위쪽에 충분한 길이를 확보합니다. 필요한 액체를 넣고 치과용 시멘트가 응고될 때까지 몇 분 동안 기다립니다.</li>
	<li>파이프의 개구부를 찾아 조심스럽게 clamp 핀셋을 사용하여 파이프를 제거합니다. 도포를 위해 치과용 시멘트 혼합물을 준비하고 두개골 전체에 균일하고 얇은 층이 펴지도록 합니다. 두개골의 표면적을 가능한 한 많은 치과용 시멘트로 덮으십시오. 치과 cemental이 굳을 때까지 몇 분 정도 기다리십시오. 알림: 치과용 시멘트가 쥐의 피부에 닿지 않도록 하십시오.</li>
	<li>높이 7mm, 외부 지름 10mm, 내부 지름 8.4mm로 수평선에서 균일하게 나뉘어진 3D 프린팅 링에 3개의 구멍(직경 1mm)을 뚫습니다. 나사(1mm 길이)를 해당 구멍에 고정합니다.</li>
	<li>임플란트의 상단을 사전 제조된 변환기의 구멍에 삽입합니다. 3D 프린팅된 링의 내벽이 매끄러운지 확인한 다음 마우스 두개골에 위치한 변환기 주위에 놓습니다. 변환기가 링 내부의 중앙에 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>링과 두개골 사이의 접합부에 치과용 시멘트를 바르고 치과용 시멘트가 응고될 때까지 몇 분 동안 기다립니다. 변환기와 두개골 사이의 연결부에 치과용 시멘트를 놓지 마십시오.</li>
	<li>변환기를 조심스럽게 제거하고 나사를 단단히 조입니다. 마우스를 따뜻한 케이지로 옮기고 원래 케이지로 되돌리기 전에 완전히 회복될 때까지 모니터링하는지 확인합니다.</li>
	<li>수술 후 진통을 위해 피하 Carprofen(2mg/kg)을 투여하고 염증 및 통증 관리를 위해 3일 동안 24시간마다 계속합니다. 고통, 비정상적인 체중 감소, 통증 또는 감염의 징후가 있는지 매일 동물을 모니터링하십시오. 일반적으로 수술 후 3일째 되는 날까지 모든 마우스는 정상적인 행동을 보여야 합니다. 3일 째 되는 날 이후에 쥐에서 고통이나 질병의 징후가 관찰되면 안락사에 대한 기관 지침을 따르십시오.</li>
</ol>5. 자극 및 신호 기록
<ol><li>수술 후 7일이 지나면 가스 마취기에 산소 공급을 켜고 산소 흐름 조절기를 조정하여 가스 흐름을 300-500mL/min으로 설정합니다.</li>
	<li>마우스를 유도 챔버에 놓고 마스크에 대한 마취 가스 전달을 닫습니다. 기화기 다이얼을 돌려 적절한 마취 농도(2%-2.5%)를 조정합니다.</li>
	<li>마우스를 마취한 후 마취 마스크로 입체 프레임에 놓습니다. 유도 라인을 닫아 마취 가스가 마취 마스크로 흐르도록 합니다. 적절한 유지 마취 농도(1%-1.5%)를 조정합니다.</li>
	<li>알코올로 임플란트의 상단 표면을 청소한 다음 광섬유 패치 코드를 준비된 변환기의 중앙에 삽입합니다.</li>
	<li>26G 바늘과 1mL 일회용 주사기를 사용하여 임플란트와 3D 프린팅 링 사이의 공간에 물을 주입하여 두개골을 적십니다. 종이 타월을 사용하여 과도한 물을 흡수하십시오.</li>
	<li>26G 바늘과 1mL 일회용 주사기를 사용하여 임플란트와 3D 프린팅 링 사이의 공간에 커플링제를 주입하여 변환기에서 뇌로 초음파를 쉽게 전파할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>임플란트를 광섬유 패치 코드에 연결합니다. 커플링제로 채워진 부분에 변환기를 조심스럽게 삽입하고 나사를 단단히 조입니다.</li>
	<li>마우스를 열린 필드에 놓고 깨어나도록 합니다. 변환기를 초음파 여기 시스템에 부착하고 광섬유 패치 코드를 광섬유 기록 시스템에 연결하여 마우스를 자유롭게 움직일 수 있습니다. 알림: 광섬유 패치 코드의 길이는 2m이고 직경은 1.25mm입니다. 405 채널의 광도는 20μW이고 470 채널의 광도는 40μW입니다.</li>
	<li>초음파 여기 장치와 광섬유 기록 시스템을 모두 활성화하여 초음파 신경 변조를 광섬유 신호 기록과 동기화합니다.</li>
</ol>

자유롭게 움직이는 마우스의 FUN 및 광섬유 광도계를 위한 통합 프로토콜

<ol>
	<li>Wang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound+for+noninvasive,+focal+pharmacologic+neurointervention.">Focused ultrasound for noninvasive, focal pharmacologic neurointervention.</a> Front Neurosci. 14, 514541 (2020).</li><li>Bystritsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+low-intensity+focused+ultrasound+pulsation.">A review of low-intensity focused ultrasound pulsation.</a> Brain stimulation. 4 (3), 125-136 (2011).</li><li>Di Ianni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ultrasound+neuromodulation+in+awake+and+freely+behaving+rats.">High-throughput ultrasound neuromodulation in awake and freely behaving rats.</a> Brain stimulation. 16 (6), 1743-1752 (2023).</li><li>Legon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+focused+ultrasound+modulates+the+activity+of+primary+somatosensory+cortex+in+humans.">Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans.</a> Nat Neurosci. 17 (2), 322-329 (2014).</li><li>Badran, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonication+of+the+anterior+thalamus+with+mri-guided+transcranial+focused+ultrasound+(tfus)+alters+pain+thresholds+in+healthy+adults:+A+double-blind,+sham-controlled+study.">Sonication of the anterior thalamus with mri-guided transcranial focused ultrasound (tfus) alters pain thresholds in healthy adults: A double-blind, sham-controlled study.</a> Brain stimulation. 13 (6), 1805-1812 (2020).</li><li>Yaakub, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+focused+ultrasound-mediated+neurochemical+and+functional+connectivity+changes+in+deep+cortical+regions+in+humans.">Transcranial focused ultrasound-mediated neurochemical and functional connectivity changes in deep cortical regions in humans.</a> Nat Comm. 14 (1), 5318 (2023).</li><li>Murphy, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tool+for+monitoring+cell+type-specific+focused+ultrasound+neuromodulation+and+control+of+chronic+epilepsy.">A tool for monitoring cell type-specific focused ultrasound neuromodulation and control of chronic epilepsy.</a> Proc Natl Acad Sci. 119 (46), e2206828119 (2022).</li><li>Niu, X., Yu, K., He, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+focused+ultrasound+induces+sustained+synaptic+plasticity+in+rat+hippocampus.">Transcranial focused ultrasound induces sustained synaptic plasticity in rat hippocampus.</a> Brain Stimulation. 15 (2), 352-359 (2022).</li><li>Tufail, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+pulsed+ultrasound+stimulates+intact+brain+circuits.">Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits.</a> Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+torpor-like+hypothermic+and+hypometabolic+state+in+rodents+by+ultrasound.">Induction of a torpor-like hypothermic and hypometabolic state in rodents by ultrasound.</a> Nat Metabol. 5 (5), 789-803 (2023).</li><li>Kubanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote,+brain+region-specific+control+of+choice+behavior+with+ultrasonic+waves.">Remote, brain region-specific control of choice behavior with ultrasonic waves.</a> Sci Adv. 6 (21), eaaz4193 (2020).</li><li>Deffieux, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-intensity+focused+ultrasound+modulates+monkey+visuomotor+behavior.">Low-intensity focused ultrasound modulates monkey visuomotor behavior.</a> Curr Biol. 23 (23), 2430-2433 (2013).</li><li>Gaur, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+safety+of+transcranial+focused+ultrasound+neuromodulation+and+magnetic+resonance+acoustic+radiation+force+imaging+in+rhesus+macaques+and+sheep.">Histologic safety of transcranial focused ultrasound neuromodulation and magnetic resonance acoustic radiation force imaging in rhesus macaques and sheep.</a> Brain stimulation. 13 (3), 804-814 (2020).</li><li>Fouragnan, E. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M4+muscarinic+receptor+signaling+ameliorates+striatal+plasticity+deficits+in+models+of+l-dopa-induced+dyskinesia.">M4 muscarinic receptor signaling ameliorates striatal plasticity deficits in models of l-dopa-induced dyskinesia.</a> Neuron. 88 (4), 762-773 (2015).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nat Meth. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Inoue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+xcamps,+a+multicolor+geci+suite+for+in+vivo+imaging+of+complex+brain+circuit+dynamics.">Rational engineering of xcamps, a multicolor geci suite for in vivo imaging of complex brain circuit dynamics.</a> Cell. 177 (5), 1346-1360.e24 (2019).</li><li>Legaria, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+photometry+in+striatum+reflects+primarily+nonsomatic+changes+in+calcium.">Fiber photometry in striatum reflects primarily nonsomatic changes in calcium.</a> Nat Neurosci. 25 (9), 1124-1128 (2022).</li><li>Kamimura, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound+neuromodulation+of+cortical+and+subcortical+brain+structures+using+1.9+mhz.">Focused ultrasound neuromodulation of cortical and subcortical brain structures using 1.9 mhz.</a> Med Phys. 43 (10), 5730-5735 (2016).</li><li>Xian, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+deep+neural+circuits+with+sonogenetics.">Modulation of deep neural circuits with sonogenetics.</a> Proc Natl Acad Sci. 120 (22), e2220575120 (2023).</li><li>Mohammadjavadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+peripheral+auditory+pathway+activation+does+not+affect+motor+responses+from+ultrasound+neuromodulation.">Elimination of peripheral auditory pathway activation does not affect motor responses from ultrasound neuromodulation.</a> Brain stimulation. 12 (4), 901-910 (2019).</li><li>Harris, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophone+measurements+for+biomedical+ultrasound+applications:+A+review.">Hydrophone measurements for biomedical ultrasound applications: A review.</a> IEEE Trans Ultrasonics Ferroelect Freq Cont. 70 (2), 85-100 (2022).</li></ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이 접근 방식은 FUN과 광학 측광 기록을 결합하여 쥐의 뇌 기능 및 생체 내 FUN 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 변환기 제작에서 수술 절차에 이르기까지 전체 운영 프로세스가 요약되어 연구원이 현장 외부에서 독립적으로 FUN을 수행할 수 있습니다.
프로토콜의 한 가지 중요한 측면은 광학 임플란트가 변환기에 매끄럽게 삽입되고, 두개골을 가로지르는 치과용 시멘트가 뇌에 초음파가 침투할 수 있을 만큼 충분히 얇고, 광학 임플란트가 두개골에 단단히 연결되어 실험 중 이탈을 방지하고, 변환기의 에너지 출력이 효과적인 신경 조절에 충분한지 확인하는 것입니다. 임플란트를 둘러싼 치과용 시멘트의 두께는 변환기 구멍의 직경과 같거나 작아야 합니다. 따라서 변환기 제작 과정과 수술 모두에 동일한 폴리프로필렌 파이프를 사용하는 것이 좋습니다. 폴리프로필렌 파이프는 치과용 시멘트에 부착되지 않기 때문에 폴리프로필렌 파이프를 쉽게 제거할 수 있도록 측면 절단으로 임플란트 주변에 치과용 시멘트를 성형하도록 선택합니다.
전기생리학적 기록 및 광학 측광 기록은 생체 내에서 뇌 활동을 모니터링하는 데 일반적으로 사용되는 기술로, 높은 시간-공간 해상도를 제공합니다. 그러나 전기생리학적 기록은 전극에 부착된 뉴런의 발화 활동 신호를 직접 포착합니다. 초음파는 전극을 직접 진동시켜 불필요한 교란 효과를 유발할 수 있습니다. 다행히도, 덜 침습적인 섬유 측광 기술은 그 아래에 있는 뉴런의 활동을 포착하여 임플란트 7,19,26에 대한 초음파 진동의 교란 효과를 줄일 수 있습니다. 결과적으로, 자유롭게 움직이는 마우스에서 동시 집속 초음파 신경 조절 및 섬유 광도 측정 기록 기술은 초음파 신경 조절의 생체 내 메커니즘을 연구할 수 있게 하고 마취의 간섭 없이 마우스의 행동 반응을 관찰할 수 있도록 합니다.
그러나, 광섬유 측광법의 공간 분해능은 세포내 및 미세회로(24)의 활동을 모니터링할 수 없기 때문에 제한된다. 또한, 신경 활동에 의해 생성된 전기 신호를 직접 기록하지 않기 때문에 신경 세포의 활동을 간접적으로 표현합니다.

집속 초음파 신경조절(FUN)은 유망하고 다재다능한 신경조절 도구로 부상하여 큰 잠재력을 가진 뇌 기능 및 조직을 탐구할 수 있습니다1. FUN은 정밀하게 뇌 조직 내의 모든 위치에 비침습적으로 음향 에너지를 전달할 수 있습니다2. 안전하고 비침습적인 방식으로 높은 시공간 특이성을 가지고 뇌 심부 구조에서 신경 활성을 일시적이고 가역적으로 조절하는 능력은 기존의 임상 신경 조절 기법을 보완하는 매력적인 특성을 제시합니다3. 효과적인 FUN의 입증은 인간 피험자 4,5,6 및 다양한 동물 모델 모두에서 확인되었으며, 이는 작은 종 7,8,9,10과 큰 종 (11,12,13,14,15,16,17)을 포함합니다.
FUN 동안 신경 활동 모니터링을 통해 특정 신경 유형에 대한 FUN의 효과를 관찰함으로써, 우리는 이 과정의 배후에 있는 메커니즘을 탐구할 수 있습니다18,19. 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(GECI)를 기반으로 하는 섬유 측광은 지난 10년 동안 생체 내 세포 유형별 집단 활동을 추적하기 위한 다양한 방법으로 널리 활용되었습니다 20,21,22,23,24. 따라서 FUN과 섬유 측광을 동시에 적용하면 FUN에 대한 포괄적인 이해를 크게 높일 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 부피가 큰 단일 트랜스듀서의 사용은 프레임에 고정을 필요로 하는 반면, 동물은 마취를 받고 입체구조프레임(7,19,25,26)에 고정되어야 한다. 이 접근 방식은 지각, 인지 및 행동 평가와 관련된 특정 유형의 실험에는 적합하지 않을 수 있습니다. 마우스의 동원을 방해하지 않으면서 FUN과 광섬유 측광의 융합을 용이하게 하는 프로토콜을 수립하는 것이 중요하다7.
이 연구에서는 단일 변환기를 제작하고 마우스에 임시로 고정하는 방법과 변환기 7,19,26의 원활한 통과를 용이하게 하기 위한 광섬유 임플란트의 안전한 고정을 매끄럽고 우아하게 보완하기 위해 이전 연구에서 사용된 세련된 프로토콜을 제시합니다. 이를 통해 연구원은 구속되지 않은 쥐에서 초음파로 조절된 신경 활성을 기록할 수 있습니다. 우리는 청각적 혼란을 줄이기 위해 정현파 외피와 같은 더 부드러운 외피를 선택했습니다27. 이 프로토콜의 실현 가능성은 FUN 동안 자유롭게 움직이는 마우스의 전방 시상 핵에서 신경 활성의 동시 기록을 통해 확인됩니다. 이는 트랜스듀서의 에너지가 신경 조절을 달성하기에 충분하며 광섬유 임플란트 및 트랜스듀서에 대한 고정 방법이 안정성을 보장할 수 있음을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1ml disposable syringe</td>
			<td>DOUBLE-DOVE</td>
			<td>1ml</td>
			<td>Injection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26-gauge needle</td>
			<td>Jin mao</td>
			<td>JM-J02</td>
			<td>Preparation needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Dong de alcohol&#160;</td>
			<td>0.7</td>
			<td>Disinfect</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alcohol</td>
			<td>Dong de alcohol&#160;</td>
			<td>0.75</td>
			<td>Clean the transducer surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bayonet Nut Connector</td>
			<td>Risym</td>
			<td>75-5</td>
			<td>The other end of the connecting wire is connected to the ultrasonic excitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper ring</td>
			<td>Guowei Metal Materials</td>
			<td>Outer diameter, wall thickness, height (8mm, 0.2mm, 8mm)</td>
			<td>The outer protective case of the transducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable syringe</td>
			<td>DOUBLE-DOVE</td>
			<td>1ml</td>
			<td>The inhalation of epoxy resin allows precise small amounts to be injected into the copper pipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>3M55236</td>
			<td>It is used to fix the transducer and the wire to ensure that the epoxy silver glue does not move before drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electronic soldering iron</td>
			<td>Victor</td>
			<td>868A+</td>
			<td>The soldered wires are connected to the BNC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epoxy resin glue</td>
			<td>Kraft</td>
			<td>K 9741</td>
			<td>Seal the rear of the transducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epoxy silver paste</td>
			<td>Vonroll</td>
			<td>CB-052</td>
			<td>The wire is attached to the positive and negative poles of the piezoelectric ceramic sheet and the resistance is kept low</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fader&#160;</td>
			<td>JOQO</td>
			<td>YP-7021</td>
			<td>Remove the head hair of the mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas anesthesia machine</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R500</td>
			<td>It is used for anesthesia in mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass sheet</td>
			<td>Square glass</td>
			<td>80mm*80mm</td>
			<td>A temporary operating surface for placing piezoelectric ceramics and wires can be used to coat the surface of the glass plate with double-sided tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine/xylazine&#160;</td>
			<td>Shutai/shengxin</td>
			<td>Zoletil 50/2ml*10</td>
			<td>Anesthetize the mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical coupling agent</td>
			<td>Bestman</td>
			<td>120g</td>
			<td>The couplant acts as a medium to conduct the ultrasound signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse</td>
			<td>Bai shi tong</td>
			<td>GCaMp6</td>
			<td>Test subject</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ophthalmic ointment</td>
			<td>Yun Zhi</td>
			<td>0.5% x 2.5 g x1</td>
			<td>Moistens the eye area to prevent blindness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;piezoelectric plate</td>
			<td>Jiaming Electronics Factory</td>
			<td>Diameter, pore, thickness (7mm, 3mm, 3.56mm)</td>
			<td>The electrical energy is emitted in the form of ultrasound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polypropylene pipe</td>
			<td>Baihao Pipe Factory</td>
			<td>Outer diameter, inner diameter, length (3mm, 2mm, 500mm)</td>
			<td>Prevent the epoxy resin from plugging the holes and leaving the holes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>povidone-iodine</td>
			<td>lefeke</td>
			<td>500ml</td>
			<td>Disinfect</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>signal record of fiber</td>
			<td>Thinker Tech Nanjing Biotech</td>
			<td>Three-color single-channel fiber optic recording system</td>
			<td>Record fiber photometry signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereotaxic frame</td>
			<td>RWD</td>
			<td>68805</td>
			<td>Fix the head of the mouse and localize the brain region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile saline</td>
			<td>Shijiazhuang si yao</td>
			<td>500ML,4.5g</td>
			<td>As a solvent, dissolves the drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stimulation of ultrasound&#160;</td>
			<td>Deep Brain Technology</td>
			<td>DB-USNM</td>
			<td>Provides stable input to the transducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>weighing machine</td>
			<td>Qin bo shi</td>
			<td>1718</td>
			<td>Weigh the mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wire</td>
			<td>Jinpeng Cable Factory</td>
			<td>0.3mm2</td>
			<td>Voltage is supplied to the transducer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous focused ultrasound neuromodulation and fiber photometry recording in free-moving mouse

집속 초음파 신경 조절(FUN)은 뇌 심부 영역에서 신경 회로의 비침습적 섭동을 위한 유망한 접근 방식을 나타냅니다. 생체 내에서 뇌 기능을 모니터링하기 위한 대부분의 기존 양식과 호환됩니다. 뇌 기능 기록 양식과의 통합은 폐쇄 루프 피드백을 통해 특정 뇌 기능의 질서와 장애를 해결할 수 있을 뿐만 아니라 FUN 자체에 대한 기계론적 통찰력을 제공합니다. 여기에서는 자유롭게 움직이는 마우스에서 FUN과 광섬유 광도 측정 GCaMP6s 형광 기록의 동시 적용을 위한 수정되고 간단하며 신뢰할 수 있고 강력한 프로토콜을 제공합니다. 여기에는 적절한 크기의 단일 트랜스듀서를 제작하고 마우스에 임시로 배치하는 것과 트랜스듀서의 원활한 통과를 용이하게 하기 위한 광섬유 임플란트의 안전한 고정이 포함됩니다. FUN과 광섬유 측광법의 조합은 뇌 심부 영역에서 실시간으로 FUN에 대한 신경 회로 반응을 광학적으로 기록할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜의 효율성을 입증하기 위해 Thy1-GCaMP6s 마우스를 예로 들어 마우스가 자유롭게 움직이는 동안 FUN 동안 전방 시상핵의 신경 활성을 기록했습니다. 우리는 이 프로토콜이 신경 과학 분야와 생물 의학 초음파 분야 모두에서 FUN의 광범위한 사용을 촉진할 수 있다고 믿습니다.

Focused ultrasound neuromodulation (FUN) has emerged as a promising and versatile neuromodulation tool, enabling the exploration of brain function and organization with great potential1. FUN is able to deliver acoustic energy noninvasively to any position within the brain tissue with pinpoint precision2. Its ability to transiently and reversibly modulate neuroactivity in deep brain structure, with high spatiotemporal specificity, in a safe and noninvasive manner, presents an appealing attribute that complements existing clinical neuromodulation technique3. Demonstration of effective FUN has been confirmed in both human subjects4,5,6 and in various animal models, encompassing small7,8,9,10 and large species11,12,13,14,15,16,17.
By observing the effect of FUN on specific neural types through neuroactivity monitoring during FUN, we can delve into the mechanism behind this process18,19. Fiber photometry based on genetically encoded calcium indicators (GECIs) has become widely utilized in the past decade as a versatile method for tracking cell-type-specific population activity in vivo20,21,22,23,24. Hence, the simultaneous application of FUN and fiber photometry can significantly enrich our comprehensive understanding of FUN. Nevertheless, the use of bulky single transducers necessitates fixation to a frame, while animals need to undergo anesthesia and be immobilized in a stereotaxic frame7,19,25,26. This approach may not be suitable for certain types of experiments related to perception, cognition, and behavior evaluation. It is crucial to establish a protocol that facilitates the amalgamation of FUN and fiber photometry without impeding the mice&#39;s mobilization7.
In this study, we present a refined protocol used in our previous studies to seamlessly and gracefully complement the method for crafting a single transducer and its temporary fixation on to the mice, as well as the secure fixation of a fiber optical implant to facilitate the smooth passage of the transducer7,19,26. It allows researchers to record the neuroactivity modulated by ultrasound in unrestrained mice. We opted for a smoother envelope, such as a sinusoidal envelope, to reduce the auditory confound27. This protocol&#39;s feasibility is confirmed through the simultaneous recording of neuroactivity in the anterior thalamic nucleus of free-moving mice during FUN. It demonstrates that the transducer&#39;s energy is sufficient to achieve neuromodulation, and the fixation methods for the fiber optical implant and the transducer can ensure their stability.

저자 스포트라이트: 자유롭게 움직이는 마우스의 신경 조절을 조사하기 위한 섬유 광도계와 집속 초음파 신경 조절의 통합

동시 집속 초음파 신경 조절 및 광섬유 광도 측정(Free-Moving Mouse)의 기록

마우스의 전방 시상핵의 위치에 해당하는 변환기 표면에서 3.4mm 떨어진 XY 평면 및 XZ 평면의 자유 음각장에서의 음압 분포는 그림 2B,C에 나와 있습니다. 이러한 측정값은 XY 도메인 및 XZ 도메인에서 수중 청음기 스캐닝을 통해 획득되었습니다. 트랜스듀서 표면에서 3.4mm 떨어진 XY 평면 및 XZ 평면의 경두개 음향장의 음압 분포는 그림 2D,E에 나와 있습니다. 측정된 자유 음압은 730kPa이고 측정된 경두개 음압은 580kHz 중심 주파수에 대해 500kPa입니다. 측정된 두개골의 두께는 평균 약 0.2mm입니다. 분산 관계가 대략 선형이라고 가정하므로 두개골의 감쇠 계수는 19.98dB/cmMHz입니다. 무게가 약 1.66g인 경량 트랜스듀서를 사용하면 마우스가 쉽게 움직일 수 있으므로 FUN에서 마우스의 반응 동작과 모션 트레일을 쉽게 관찰할 수 있습니다.
광섬유 신호는 FUN(그림 4B,D)에 따라 기록되었으며 엔벨로프는 각각 정사각형 및 정현파입니다. 실험에는 5마리의 수컷 쥐가 사용되었습니다. 사각형은 300ms 동안 지속된 반면 연속 정현파는 471ms 동안 지속되었으며, 이는 총 에너지가 두 개의 다른 FUN에서 동일하다는 것을 보장할 수 있습니다(그림 4A, C). 광섬유 신호의 향상은 신경 활동의 증가를 나타냅니다. 신경 반응은 FUN에서 빠르며, 이는 변환기가 충분한 에너지와 우수한 초점 능력을 가지고 있음을 시사합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig01.jpg"> 그림 1: 트랜스듀서의 생산 공정. 이것은 차례로 압전 시트를 와이어에 연결한 다음 패키징하는 것을 포함합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig02v2.jpg"> 그림 2: 초음파 트랜스듀서에 대한 초음파 필드 측정 설정 및 특성화. (A) 초음파장 측정 설정에는 수중 청음기, 모터 시스템, 제어 소프트웨어, 신호 발생기 및 오실로스코프가 포함됩니다. (나, D) 자유 및 경두개 음향장에서의 초음파 변환기 측정의 개략도와 횡방향 및 종방향 음장 측정 결과. (씨, 마) 변환기 초점 위치의 횡방향 음장 다이어그램, 빨간색 선은 -3dB 위치의 음장을 나타냅니다. (에프, 지) 변환기에 대한 수중 청음기에 의해 측정된 출력의 파형 다이어그램. 빨간색 점선 상자 안의 영역과 파란색 점선 상자 안의 영역은 각각 파형이 안정적인 진폭에 도달하기 전의 기간과 끝에서 트랜스듀서의 링잉 기간을 나타냅니다. 주황색 점선 상자 안의 영역은 p로 표시된 압력 진폭을 계산하는 데 사용되는 파형의 안정적인 부분을 나타냅니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig02largev2.jpg" target="_blank">. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig03.jpg"> 그림 3: 계산 소프트웨어 및 초음파 매개변수. (A) 수제 초음파 매개 변수 계산 인터페이스. MI, Isppa 및 Ispta 가 계산되었습니다. 인터페이스는 https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation 에서 얻을 수 있습니다. (B) 초음파 압력 파형의 개략도. 사인파 Pulse Envelope와 직사각형 Pulse Envelope가 사용됩니다. 주기(T)는 작동 주파수의 단일 주기의 지속 시간을 나타냅니다. 단일 연속 초음파 처리로 알려진 맥박은 맥박 지속 시간 (PD)이라고하는 지정된 기간 동안 지속됩니다. 일반적으로 펄스는 펄스 트레인으로 알려진 시퀀스로 반복됩니다. 펄스 트레인에서 두 개의 연속된 펄스 사이의 시간 간격을 펄스 반복 간격(PRI)이라고 하며, 펄스 반복 주파수(PRF)의 역수로 계산됩니다. 펄스 트레인(pulse train)으로 알려진 전체 펄스 시퀀스에는 펄스 트레인 지속 시간(pulse train duration)으로 알려진 특정 지속 시간이 있습니다. 간격 시간은 단일 시도의 기간을 의미합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig04v2.jpg"> 그림 4: FUN 중 섬유 측광 신호. (ᅡ, ᄃ) 정사각형(B)과 정현파(D)로 둘러싸인 초음파 매개변수. (나, D) (A) 및 (C)의 FUN 동안 각각 광섬유 측광 신호. 녹색 그림자는 FUN의 지속 시간입니다. 실선은 평균이고 파란색과 빨간색 음영은 기록된 신호의 평균과 표준 편차입니다. 실험에는 5마리의 수컷 쥐가 사용되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig04largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜에는 자유롭게 움직이는 마우스에서 동시 집속 초음파 신경 조절 및 광섬유 광도 측정의 전체 운영 워크플로우를 위한 변환기 제조, 파라미터 보고, 수술 절차 및 신호 기록이 포함됩니다.

Focused ultrasound neuromodulation (FUN) represents a promising approach for non-invasive perturbation of neuronal circuits at deep brain regions. It is ...

simultaneous-focused-ultrasound-neuromodulation-fiber-photometry

동시 집속 초음파 신경 조절 및 광섬유 광도 측정(Free-Moving Mouse)의 기록

Abstract