זרימת עבודה חדשה לדגימה ודיגיטציה של ליבות הפרש קבוע

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לשימוש בתושבות המודפסות בתלת-ממד כדי לתקן ליבות תוספות בשטח ללא צורך לפרוק ולהדביק אותן על תושבות עץ. מחזיק ה-GSC החדש מאפשר למקם את הליבות במיקרוטום ליבה כדי לחתוך את פני השטח שלהן ולהעביר אותן ישירות ללכידת תמונה דיגיטלית.

Abstract

כאן אנו מציגים זרימת עבודה חדשה מלקיחת ליבות תוספות בשטח, אחסונן והובלתן למעבדה, לדיגיטציה של טבעות העצים שלהן לצורך ניתוחים נוספים לניתוחים דנדרואקולוגיים עוקבים. ההליך כולל שימוש בנשאים מדגם חדשים עבור ליבות תוספת. מחזיקי Gärtner Schneider Core (GSC) החדשים הללו מתוכננים באמצעות תוכנת מידול תלת-ממדית (3D) ולבסוף מודפסים במדפסת תלת-ממד. באמצעות תושבות אלה מההתחלה בשטח, ניתן לחתוך את הליבות ישירות באמצעות מיקרוטום ליבה, ולאחר מכן ניתן להפוך את פני השטח שלהן לדיגיטליים ללא סידור מחדש נוסף באמצעות מערכת לכידת תמונות חדשה ברזולוציה גבוהה. לכן הם זמינים לניתוח ישיר. מערכת זו מאפשרת דיגיטציה של טבעות עצים מליבות ודיסקים, וכן צילום תמונות מקטעים זעירים ארוכים (עד 40 ס"מ) באמצעות אור משודר. תכונה זו היא בעלת עניין מיוחד עבור יישומים דנדרואקולוגיים וגיאומורפיים כדי לזהות את תחילתה של כל הפרעה במקטעים מיקרו חתוכים עם מיקרוטום הליבה.

Introduction

העיקרון של תיארוך טבעות עצים על ידי יישום טכניקת התיארוך המשולב הוצג לראשונה על ידי מדען היערות האוסטרי ארתור פרייהר פון זקנדורף-גודנט בשנת 1881¹. במחצית הראשונה של המאה^ה-20 , טכניקה זו הומצאה מחדש על ידי "אבי הדנדרוכרונולוגיה" אנדרו אליקוט דאגלס, שיישם אותה באופן אינטנסיבי בתיארוך אתרים ארכיאולוגיים ועצים חיים².

כיום, דנדרואקולוגיה, נושא המחקר הפועל כמעין מסגרת סביבתית של דנדרוכרונולוגיה, מוגדרת כחקר טבעות עצים ושינויי הצמיחה הטבועים בהן הנגרמות על ידי שינויים אקולוגיים וסביבתיים בזמן³. במחקר דנדרואקולוגי, מאפיינים רבים אחרים מלבד שינויים ברוחב הטבעת, כגון איזוטופים יציבים, צפיפות עץ מאוחרת או מאפייני תאים בתוך טבעות בודדות, משמשים כדי להתאים נתונים אלה לפרמטרים סביבתיים כדי להבין טוב יותר את ההשפעה של תנאי הסביבה על צמיחת עצים לאורך זמן⁴. באמצעות השילוב המתמשך של מחקרים אנטומיים של עץ למחקר דנדרואקולוגי, המחקר הדנדרואקולוגי התפתח בעשור האחרון והוא יותר מתמיד עמוד השדרה בשחזור תנאי אקלים קודמים 5,6,7,8.

למרות שההתפתחות הטכנית בכל הנוגע להכנת הדגימות וניתוחן, במיוחד באנטומיה של עץ, הייתה חזקה בעשור האחרון 9,10,11,12,13,14, כמעט ולא הייתה התקדמות של ממש לגבי פישוט טכניקות הדגימה ¹⁵. למרות, למשל, טכנולוגיית גלים אקוסטיים¹⁶, עד היום אין שיטה "לא הרסנית" אמינה לחילוץ תכונות הטבעות מעצים.

כתוצאה מכך, כל המחקרים הקשורים לטבעות עצים עדיין מסתמכים על דגימות עץ שנלקחו מעצים או שיחים שנלקחו באתרים המעניינים. כאשר מתמקדים בעצים, ההליך הסטנדרטי הוא לקיחת ליבות תוספות מגבעולים¹⁵.

לקיחת ליבות באמצעות ליבות מצטברות מתבטאת לעתים קרובות כטכניקה "לא הרסנית"¹⁷. בהשוואה ללקיחת דיסקים מגבעולים, זה נכון; עם זאת, טכניקת דגימה זו גורמת לחור בגבעול בקוטר של כ-1 ס"מ, המגיע ברובו מעבר לפיתה של הגבעול³. העץ מסוגל לסגור פצע זה בכוחות עצמו, אך תהליך זה גורם לתגובות צמיחה, שינוי המבנה הנפוץ בסביבה הקרובה של הפצע וכן שינוי צבע אינטנסיבי פחות או יותר של העץ הקיים סביב החור בגלל מחלות פטרייתיות^18,19. לכן, עדיף לקרוא לזה "זעיר פולשני" ולא "לא הרסני".

הטכניקה של לקיחת ליבות תוספות התפתחה לאחרונה באמצעות היכולת להשתמש במקדחות מכניות, וכתוצאה מכך דגימות באיכות גבוהה יותר, במיוחד עבור אנליזות אנטומיות עץ¹⁵. הליך זה גם חוסך זמן רב בשטח בהשוואה לגימור ידני. מה שנותר ללא שינוי היה הליך הטיפול בליבות, החל מהחילוץ מהעץ ועד לתיוג, אחסון להובלה והכנתם במעבדה לטכניקות ניתוח אפשריות שונות.

ליבות עדיין צריך להיות ארוז במיכלים יציבים, כגון קשיות עשויות פלסטיק או נייר, כדי למנוע מהם להישבר במהלך ההובלה. תיוג הליבות נעשה ישירות על הליבה באמצעות עפרונות רכים או (בתדירות גבוהה יותר) בחלק החיצוני של כל קשית. בעת שימוש במיכלי פלסטיק, יש להוציא את הליבות לאחר זמן קצר כדי למנוע התפשטות פטריות. אז, את הליבות צריך להוציא מתוך המיכלים שוב. כדי לייצב את הליבות ולמנוע מהן להתכופף כאשר הן מתחילות להתייבש, יש לקבע את הליבות על תושבת. זה גם עוזר עם הכנת פני השטח הבאים לניתוחים נוספים. כאשר עושים זאת, יש להעביר את התוויות גם לתושבות המתאימות. הליך סטנדרטי הוא הדבקת הליבות על תושבות עץ או קיבוע אותם עם סרט ב rills של לוחות גלי. הדבקתם על תושבות עץ היא הטכניקה הנפוצה ביותר. למרות שהליך זה מושלם לייצוב ושיוף או חיתוך הליבות, יש לו מספר חסרונות לגבי ניתוחים אנטומיים פוטנציאליים, איזוטופיים ואפילו עץ. חסרון נוסף, למרות הזמן הנדרש, הוא העברה מועדת לשגיאות של התוויות עבור כל ליבה לתושבות החדשות.

בדנדרוכרונולוגיה, מדידות רוחב טבעת כבסיס לתיארוך מדויק הן עמוד השדרה של כל המחקרים הדנדרואקולוגיים²⁰. למרות שמעבדות רבות עדיין מסתמכות על מדידות ידניות באמצעות טבלאות מדידה, למשל, Lintab²¹ עם משקפת מחוברת, קיימת מגמה של שימוש בסורקים שטוחים כדי להפוך משטחי ליבה לדיגיטליים ולמדוד רוחב טבעת באמצעות תוכנות כגון CooRecorder²² או WinDENDRO²³. למרבה הצער, לסורקים אלה, למשל Epson Expression 10000XL הנמצאים בשימוש נרחב, אין רזולוציה מספקת כדי לתאר בבירור מבנים כטרכאידים מעץ מוקדם או מעץ מאוחר (איור 1). מסיבה זו, התמונות המתקבלות אינן מתאימות לזיהוי מבנים קשים כגון טבעות צרות מאוד או תנודות צפיפות, שהן קריטיות להליך הצלבה מדויק מבלי לחזור לליבות המקוריות באמצעות משקפת^24,25.

מכיוון שרזולוציית תמונה גבוהה היא תנאי הכרחי לניתוח תמונה הולם במדע טבעות עצים¹⁰, פותחה מערכת חדשה ללכידת תמונות ב- WSL (Skippy; https://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/) כדי להפוך טבעות עצים על משטחי ליבה לדיגיטליות באמצעות מצלמה דיגיטלית וכתוצאה מכך תמונות מציגות רזולוציה גבוהה יותר מכל הסורקים השטוחים הקיימים. מערכת זו התבססה על הרעיון של מערכת ATRICS²⁶, שפותחה בשנת 2007. לאחרונה, מערכת לכידת תמונות פשוטה אך יעילה הדומה ל- Skippy הוצגה כערכת הרכבה עצמית²⁷.

דיגיטציה של טבעות עצים, כלומר לכידת תמונות אור מוחזרות, היא צעד חשוב ביצירת תמונות ברזולוציה גבוהה של ליבות או דיסקים במרווחים כדי לתמוך במדידת רוחב טבעת דיגיטלית חסכונית בזמן. המערכת שפותחה ב-WSL מאפשרת גם לצלם תמונות ממקטעים מיקרו ארוכים (עד 40 ס"מ) באמצעות אור משודר. תכונה נוספת זו מעניינת, למשל, יישומים דנדרוגאומורפיים לזיהוי תחילתו של עץ תגובה במקטעים מיקרו.

במחקר אנו מציגים פרוטוקול המקל על תהליך הטיפול בליבות בשטח ובמעבדה. הבסיס של הטכניקה החדשה שהוצגה הוא תושבת לשימוש חוזר; מחזיק ה-GSC החדש GärtnerSchneiderCore (GSC) תוכנן באמצעות תוכנת מידול תלת-ממד והודפס במדפסת תלת-ממד. מחזיק GSC מאפשר טיפול פשוט של הליבות שנלקחו בשטח מבלי לארוז מחדש או לתייג אותן מחדש. כמו כן, אנו מציגים מערכת חדשה ויעילה לדיגיטציה של המשטחים המוכנים של הליבות. פרוטוקול זה מקיף את כל ההליך החל מלקיחת ליבות בשטח ועד להכנת דגימות, דיגיטציה של משטחי הליבה לניתוחים הבאים, ובסופו של דבר אחסונם בארכיון.

Protocol

1. יצירת מחזיק GSC

1. פתח את המודל התלת-ממדי של המחזיק בתוכנית כלי פריסה התואמת למדפסת תלת-ממד. צור קובץ הדפסה שניתן לקריאה על-ידי מדפסת התלת-ממד (במקרה זה, קובץ "*.gcode").
   הערה: ניתן לעצב את המודל התלת-ממדי באמצעות כל תוכנת מידול תלת-ממדית.
2. העבר את קובץ ההדפסה למדפסת התלת-ממד באמצעות כרטיס זיכרון או התקן USB והפעל את קובץ ההדפסה במדפסת התלת-ממד.
3. מיד עם הדפסת המחזיק, המתן עד שהמחזיק יתקרר לטמפרטורת החדר (RT). לאחר מכן, הסר את הלוח שהמחזיק נדבק אליו מהמדפסת וכופף מעט את הלוח עד שהצורה תיפרד מהמשטח.
4. הסר את כל הליכי המשנה או הקבצים המצורפים מהמחזיק.
   הערה: מספר המחזיקים שיש להדפיס בבת אחת תלוי בגודל המדפסת. במדפסת תלת-ממד עם מידות לוח של 36 ס"מ x 36 ס"מ, ניתן להדפיס כ-30 מחזיקים באורך של 35 ס"מ בהפעלה אחת. הזמן הדרוש להדפסת 30 מחזיקים תלוי בהתקן. בממוצע, זה צריך להיעשות בערך 8 שעות (הדפסה לילה).

2. חילוץ, ייצוב ושינוע ליבות תוספות בשטח

1. קח מקדחה אלחוטית המצוידת במאיץ מומנט וקורר תוספת, בחר את מיקום הקורינג והנח את הקורר בניצב לציר הגידול של הגבעול.
   הערה: ניתן לעשות את אותו הדבר באופן ידני באמצעות corer ההפרש ללא מקדחה אלחוטית.
2. התחל coring עד corer מגיע לפחות מחצית קוטר הגבעול. בדוק את העומק כפי שהוסבר לעיל על ידי החזקת המחלץ (שיש לו אורך זהה לקורר) לצד הקורר.
3. במקרה של שימוש במקדחה אלחוטית, הסירו את המקדחה, הניחו את הידית על הקורר (וזה כבר המקרה בעת שימוש ידני בקורר ההפרש), קחו את המחלץ כשהצד הפתוח פונה כלפי מעלה, והכניסו אותו במלואו לתוך הקורר.
4. סובב את קורר ההפרשים לאחור (סיבוב אחד מלא) כדי לשבור את הליבה מהגבעול. מוציאים את המחלץ, כולל הליבה.
5. הסר את הליבה מהקולט לחילוץ. בדוק את כיוון הסיבים של הליבה כדי להבטיח כיוון זקוף של הסיבים בעת הנחת הליבה במחזיק.
   הערה: ניתן לבדוק את כיוון הסיבים בשני קצוות הליבה, כמו גם בצד הליבה. לשם כך, החזיקו את הליבה כנגד האור וסובבו אותה עד שנראה צד זוהר. זה קורה כי, בצד זה, קירות התא הרדיאלי נחתכים לאורך ומחזירים אור באופן שונה משאר הליבה.
6. הניחו את הליבה על גבי המחזיק כשכיוון הסיב זקוף. לחץ על גבי הליבה עם כל האצבעות עד שהליבה תחליק לתוך המחזיק.
7. תייגו את הליבה בצד המחזיק באמצעות עיפרון רך, המאפשר כתיבה אפילו על זכוכית.
   הערה: מאוחר יותר ניתן להסיר את הכתב באמצעות גומי משותף.
8. הכניסו את המחזיק עם הליבה לקופסת ההובלה וסגרו את הכיסוי.

3. הכנת הליבות המותקנות במעבדה

1. אופציונלי: הטמעת הליבות המותקנות בפרפין לחיתוך מיקרו פוטנציאלי.
   1. מניחים קופסת פלדה עם מכסה מצויד בשסתום לחיבור משאבת ואקום על פלטה חשמלית, ממלאים אותה עד כ-2 ס"מ בפרפין וממתינים עד שהיא נמסה לחלוטין.
   2. הוציאו את הליבות הרכובות מתיבת ההובלה. מניחים את המחזיקים עם הליבות כפי שהם בפרפין נוזלי ולסגור את המכסה.
   3. הפעילו את משאבת הוואקום, הפעילו ואקום קבוע וקל על המיכל והמתינו כשעתיים. בשל המבנה הפתוח של המחזיק, הפרפין יכול לחדור את הליבות ללא מחסומים נוספים.
   4. עצור את משאבת הוואקום ופתח את המכסה. הוציאו את המחזיקים עם הליבות, הניחו אותם על רשת ותנו להם להתקרר.
   5. במידת הצורך, מוציאים עודפי פרפין מצידי המחזיק.
2. הכנת משטחי הליבה
   1. הוציאו את הליבות הרכובות מתיבת ההובלה או מאמבט הפרפין. מקם את המחזיק עם הליבה כפי שהיא במחזיק הדגימה של מיקרוטום הליבה. הקפידו לכוון את הליבה באופן שהעץ המאוחר של הטבעות פונה לכיוון הלהב.
   2. הדקו את הברגים של מחזיק הדגימה עד שמחזיק הליבה מאובטח לחלוטין.
   3. הרימו את מחזיק הדגימה עד שהליבה נוגעת קלות בלהב. משוך את הלהב לכל היקף הליבה כדי לחתוך את החלק הראשון של החלק העליון.
   4. דחפו את הסכין לאחור מאחורי הליבה, הרימו את מחזיק הדגימה כמה מיקרונים, וחזרו על התהליך עד לקבלת משטח מישור ברוחב של לפחות 2-3 מ"מ.
   5. ברגע שהמשטח נחתך כמתוכנן, הסר את מחזיק הליבה ממחזיק הדגימה של המיקרוטום.
      הערה: מומלץ לחתוך את הליבות עם מיקרוטום ליבה ולא ללטש אותן מכיוון שהמשטח נקי וישר יותר, והתאים אינם מלאים באבק.

4. דיגיטציה של משטחי הליבה

1. מקם את מחזיק הליבה עם משטח הליבה הרגיל על השולחן של מערכת לכידת תמונות, כפי שמערכת WSL-Skippy מוצגת כאן.
2. הקפד ליישר את מחזיק הליבה לכיוון התנועה של השולחן או המצלמה.
3. מקם את הטבלה עם מחזיק הליבה מתחת למצלמה כדי שהטבעת החיצונית ביותר תהיה במרכז הראייה מתחת למטרת המצלמה.
4. מקם קנה מידה ליד תחילת הליבה וצלם תמונה למטרות כיול.
   הערה: יש לעשות זאת פעם אחת בלבד בעת ביצוע תמונות של ליבות רבות ברצף.
5. הגדר את אורך הליבה בתוכנה והתחל בתהליך לכידת התמונה. כאשר התמונה האחרונה מצולמת, הטבלה חוזרת למיקום ההתחלה.
6. הסר את הדגימה מהטבלה, מקם את המחזיק הבא מתחת למצלמה וחזור על התהליך שתואר קודם לכן על ידי הגדרת אורך הליבה עד שכל הליבות מצולמות.
7. השתמש בתוכנת תפירה (ללא עיוותים), לדוגמה, PTGui, כדי לשלב את התמונות הבודדות לתמונה סופית אחת של משטח הליבה.

5. אחסון הליבות

1. קח את הליבות שנותחו במחזיק והנח אותן במדף האחסון הנייד המודפס באמצעות מדפסת תלת מימד.
2. תייג את ארון התקשורת כדי לזהות את הליבות מבחוץ.
3. אחסן את המדף על מדף או על כל ארכיון זמין אחר.

Discussion

הכללת אנטומיה של עץ במחקרים דנדרואקולוגיים פתחה מחקרים אלה באופן נרחב לניתוחים חדשים ומעמיקים של תנאי סביבה בעבר 28,29,30. טכניקות חדשות אלה גם הגבירו את המאמצים האנליטיים, כלומר זמן המעבדה הדרוש כדי להפיק את הנתונים המעניינים. נעשו ניסיונות רבים לייעל את עבודת המעבדה ולצמצם את הזמן הדרוש במעבדה בנוגע לטכניקות אנטומיות עץ 9,12,13,15,30. אך כמעט ולא נעשו מאמצים להקל על ההליך הנפוץ של טיפול, הכנה ואחסון של ליבות שנלקחו עבור מחקרים אלה.

הדפסה תלת מימדית מציעה אפשרויות חדשות בהקשר זה⁹. מחזיק הליבה החדש, המודפס בתלת-ממד, הוא הניסיון הראשון לפשט את כל התהליך הזה, מה שהופך אותו לפחות גוזל זמן ולשם כך יעיל יותר.

בעוד ליבות המאוחסנות בקשיות פלסטיק^31,32 או במיכלים דומים צריכות להיות מוצאות החוצה כדי למנוע התפתחות פטריות בחלק החיצוני (ובקרוב גם הפנימי) של הליבה, ליבות קבועות במחזיקי GSC יכולות להישאר כפי שהן. עד כאן ניתן להשוות את אחסונם בקשיות נייר³³.

היתרון מתברר ברגע שכל ההליך של (i) הסרת הליבות מהקש (או מיכל אחר), (ii) הדבקתן על תושבות עץ או קיבוע שלהן על אובייקטים אחרים כתומכי כבלים, ו-(iii) התהליך המועד לשגיאות של העברת הקוד המתאים המשמש לכל ליבה כפי שהיה כמעט תקן במשך עשרות שנים^{כבר 34}, הופך להיות מיותר.

המבנה הפתוח של מחזיק GSC מאפשר לאחסן את הליבות ללא הסיכון של התפשטות פטרייתית, כפי שיהיה במקרה כאשר מאוחסן במיכל פלסטיק. כפי שתואר לעיל, המחזיק מאפשר גם הטבעה בפרפין כדי לייצב את המבנה. עם זאת, לא ניתן להשוות הטבעה "פשוטה" זו להליכי הטבעה נפוצים באמצעות קלטות להטמעת הדגימה בבלוק פרפין כפי שנעשה עבור ליבות מיקרו³⁵. הטכניקה הפשוטה דומה למדי ליישום עמילן תירס בעת חיתוך מיקרו חלקים³⁶. זה ייצב טוב יותר את התאים וימנע מהם להישבר במהלך הליך החיתוך, אבל זה לוקח יותר זמן מאשר פשוט להוסיף עמילן תירס. צורת הטבעה זו לא תייצב את כל הליבה כאילו הוטבעה בבלוק. אם הליבה שבורה, גם החלקים יישברו. מכיוון שמחזיק GSC מתאים לליבת מיקרוטום³⁷, הכנת פני השטח לתהליך הדיגיטציה הבא אורכת מספר דקות בלבד.

עבור תהליך הדיגיטציה של טבעות עצים, היישום של סורקים שטוחים, המשמשים לעתים קרובות למדידות עוצמה כחולה^38,39, לא היה משביע רצון לגבי תצוגות מפורטות יותר של מבנה הטבעת, בגלל האיכות הנמוכה למדי של התמונות שהתקבלו. למרות שגבולותיהן של טבעות מחטניות נפוצות (רחבות) נראו בתמונות אלה, טבעות צרות, או אפילו תנודות צפיפות, היו כמעט בלתי אפשריות לזיהוי.

למרות שישנם ניסיונות חדשים ומרתקים לדיגיטציה של טבעות עצים ברזולוציה גבוהה, כגון רנטגן CT⁴⁰, שימוש במצלמות דיגיטליות ברזולוציה גבוהה הוא עדיין הדרך היעילה והחסכונית ביותר להפיק תמונות באיכות גבוהה למדידות נוספות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Core-microtome	WSL	https://www.wsl.ch/en/services-produkte/microtomes/	Microtome to cut micro sections from increment cores
Epson Expression 10000XL	EPSON	https://epson.com/Support/Scanners/Expression-Series/Epson-Expression-10000XL---Graphic-Arts/s/SPT_E10000XL-GA	flatbed scanner
GSC holder	WSL	in-house	3D printed mount to fix cores for transport, preparation, analyses, and storage
Skippy image capturing system	WSL	https://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/)	Image capturing system developed at WSL equiped with a 61 MP camera (Sony Alpha 7R IV and Sony FE 90mm f/2.8 Macro lens)