Um novo fluxo de trabalho para amostragem e digitalização de núcleos de incremento

Summary

Apresentamos um protocolo para usar montagens impressas em 3D para fixar núcleos de incremento no campo sem a necessidade de desembalá-los e colá-los em montagens de madeira. O novo suporte GSC permite colocar os núcleos em um micrótomo central para cortar sua superfície e transferi-los diretamente para a captura digital de imagens.

Abstract

Aqui, apresentamos um novo fluxo de trabalho, desde a coleta de núcleos de incremento no campo, armazenando-os e transportando-os para o laboratório, até a digitalização de seus anéis de árvores para análises dendroecológicas posteriores. O procedimento envolve o uso de novos portadores de amostra para núcleos de incremento. Esses novos suportes Gärtner Schneider Core (GSC) são projetados usando software de modelagem tridimensional (3D) e, finalmente, impressos com uma impressora 3D. Usando essas montagens desde o início no campo, os núcleos podem ser cortados diretamente com um micrótomo central e sua superfície pode ser digitalizada sem rearranjo adicional usando um novo sistema de captura de imagem de alta resolução. Eles estão, portanto, disponíveis para análise direta. Este sistema permite digitalizar anéis de árvores a partir de núcleos e discos, e também tirar imagens de micro seções longas (até 40 cm) usando luz transmitida. Esta característica é de especial interesse para aplicações dendroecológicas e geomórficas para identificar o início de qualquer perturbação em micro seções cortadas com um micrótomo central.

Introduction

O princípio da datação dos anéis das árvores aplicando a técnica de datação cruzada foi introduzido pela primeira vez pelo cientista florestal austríaco Arthur Freiherr von Seckendorff-Gudent em 1881¹. Na primeira metade do^século 20, essa técnica foi reinventada pelo "Pai da Dendrocronologia" Andrew Ellicott Douglass, que a aplicou intensamente na datação de sítios arqueológicos e árvores vivas².

Atualmente, a dendroecologia, o tópico de pesquisa que atua como uma espécie de quadro ambiental da dendrocronologia, é definida como o estudo dos anéis de crescimento e suas variações de crescimento inerentes causadas por mudanças ecológicas e ambientais no tempo³. Na pesquisa dendroecológica, muitas outras características além das variações da largura do anel, como isótopos estáveis, densidade tardia da madeira ou características celulares dentro de anéis únicos, são usadas para correlacionar esses dados a parâmetros ambientais para entender melhor o impacto das condições ambientais no crescimento das árvores ao longo do tempo⁴. Por meio da integração contínua dos estudos anatômicos da madeira à pesquisa dendroecológica, a pesquisa dendroecológica evoluiu na última década e é mais do que nunca uma espinha dorsal na reconstrução das condições climáticas passadas 5,6,7,8.

Embora o desenvolvimento técnico em relação ao preparo e análise de amostras, especialmente em anatomia da madeira, tenha sido forte na última década 9,10,11,12,13,14, quase não houve avanço real em relação à simplificação das técnicas de amostragem ¹⁵. Apesar, por exemplo, da tecnologia de ondas acústicas¹⁶, até hoje não existe um método "não destrutivo" confiável para extrair as características dos anéis das árvores.

Consequentemente, todos os estudos relacionados aos anéis de árvores ainda dependem de amostras de madeira retiradas de árvores ou arbustos coletados nos locais de interesse. Ao focar em árvores, o procedimento padrão é tirar núcleos de incremento das hastes¹⁵.

A obtenção de testemunhos usando testemunhos de incremento é freqüentemente expressa como uma técnica "não destrutiva"¹⁷. Comparado a tirar discos de hastes, isso está correto; No entanto, essa técnica de amostragem causa um orifício no caule de cerca de 1 cm de diâmetro, atingindo principalmente além da medula do caule³. A árvore é capaz de fechar essa ferida sozinha, mas esse processo causa reações de crescimento, alterando a estrutura comum nas proximidades da ferida, bem como uma descoloração mais ou menos intensa da madeira existente ao redor do buraco por causa de doenças fúngicas^18,19. Portanto, deve ser melhor chamado de "minimamente invasivo" em vez de "não destrutivo".

A técnica de retirada de testemunhos de incremento evoluiu recentemente através da capacidade de uso de brocas mecânicas, resultando em amostras de maior qualidade, especialmente para análises anatômicas de madeira¹⁵. Este procedimento também economiza muito tempo no campo em comparação com a retirada do núcleo manual. O que permaneceu inalterado foi o procedimento de manuseio dos núcleos, desde a extração da árvore até a rotulagem, armazenamento para transporte e preparação em laboratório para várias técnicas de análise possíveis.

Os núcleos ainda precisam ser embalados em recipientes estáveis, como canudos feitos de plástico ou papel, para evitar que se quebrem durante o transporte. A rotulagem dos núcleos é feita diretamente no núcleo usando lápis macios ou (mais frequentemente) na parte externa de cada canudo. Ao usar recipientes de plástico, os núcleos devem ser retirados após um curto período de tempo para evitar a propagação de fungos. Portanto, os núcleos precisam ser retirados dos contêineres novamente. Para estabilizar os núcleos e evitar que dobrem quando começarem a secar, os núcleos precisam ser fixados em um suporte. Isso também ajuda na preparação subsequente da superfície para análises posteriores. Ao fazer isso, as etiquetas também precisam ser transferidas para as respectivas montagens. Um procedimento padrão é colar os núcleos em suportes de madeira ou fixá-los com fita adesiva nos riachos de papelão ondulado. Colá-los em suportes de madeira é a técnica mais usada. Embora este procedimento seja perfeito para estabilizar e lixar ou cortar os núcleos, ele tem várias desvantagens em relação a possíveis análises anatômicas químicas, isotópicas e até mesmo de madeira. Outra desvantagem, apesar do tempo necessário, é a transferência propensa a erros das etiquetas de cada núcleo para as novas montagens.

Em dendrocronologia, as medições da largura do anel como base para datações precisas são a espinha dorsal de todos os estudos dendroecológicos²⁰. Embora muitos laboratórios ainda dependam de medições manuais usando tabelas de medição, por exemplo, Lintab²¹ com binóculos acoplados, há uma tendência de usar scanners de mesa para digitalizar superfícies de núcleo e medir a largura do anel usando software como CooRecorder²² ou WinDENDRO²³. Infelizmente, esses scanners, por exemplo, o amplamente utilizado Epson Expression 10000XL, não têm resolução suficiente para descrever claramente as estruturas como traqueídeos de madeira inicial ou tardia (Figura 1). Por esse motivo, as imagens resultantes não são adequadas para reconhecer estruturas difíceis, como anéis muito estreitos ou flutuações de densidade, que são críticas para um procedimento preciso de datação cruzada sem voltar aos núcleos originais usando binóculos ^24,25.

Uma vez que a alta resolução de imagem é um pré-requisito indispensável para análises de imagem adequadas na ciência dos anéis de árvores¹⁰, um novo sistema de captura de imagens foi desenvolvido no WSL (Skippy; https://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/) para digitalizar anéis de árvores nas superfícies do núcleo usando uma câmera digital, resultando em imagens apresentando uma resolução mais alta do que todos os scanners de mesa existentes. Este sistema foi baseado na ideia do sistema ATRICS²⁶, desenvolvido em 2007. Mais recentemente, um sistema de captura de imagem simples, mas eficiente, comparável ao Skippy foi apresentado como um kit de automontagem²⁷.

A digitalização de anéis de árvores, ou seja, a captura de imagens de luz refletida, é uma etapa importante na criação de imagens de alta resolução de núcleos ou discos de incremento para suportar uma medição de largura de anel com eficiência de tempo e baseada digitalmente. O sistema desenvolvido na WSL também permite tirar imagens de micro cortes longos (até 40 cm) usando luz transmitida. Essa característica adicional é, por exemplo, de interesse para aplicações dendrogeomórficas para identificar o início da madeira de reação em micro seções.

No estudo, apresentamos um protocolo para facilitar o processo de manuseio de testemunhos no campo e no laboratório. A base da nova técnica apresentada é uma montagem reutilizável; o novo suporteGSC G ärtnerSchneiderCore (GSC) projetado usando software de modelagem 3D e impresso com uma impressora 3D. O suporte GSC permite o manuseio direto dos núcleos retirados no campo sem reembalá-los ou rotulá-los novamente. Também apresentamos um novo sistema eficiente para digitalizar as superfícies preparadas dos machos. Este protocolo abrange todo o procedimento, desde a coleta de testemunhos em campo até a preparação de amostras, digitalização das superfícies de testemunhos para análises subsequentes e, eventualmente, armazenamento em um arquivo.

Protocol

1. Criação do titular do SGC

1. Abra o modelo 3D do suporte em um programa de fatiamento compatível com uma impressora 3D. Crie um arquivo de impressão que possa ser lido pela impressora 3D (neste caso, um arquivo "*.gcode").
   NOTA: O modelo 3D pode ser projetado usando qualquer software de modelagem 3D.
2. Transfira o arquivo de impressão para a impressora 3D usando um cartão de memória ou um pendrive e ative o arquivo de impressão na impressora 3D.
3. Assim que o suporte for impresso, aguarde até que o suporte esfrie até a temperatura ambiente (RT). Em seguida, remova a placa em que o suporte adere da impressora e dobre um pouco a placa até que a forma se separe da superfície.
4. Remova todas as linhas ou acessórios em excesso do suporte.
   NOTA: O número de suportes a serem impressos de uma só vez depende do tamanho da impressora. Numa impressora 3D com uma dimensão de chapa de 36 cm x 36 cm, pode-se imprimir cerca de 30 suportes com um comprimento de 35 cm numa só tiragem. O tempo necessário para imprimir 30 suportes depende do dispositivo. Em média, isso deve ser feito em aproximadamente 8 h (impressão noturna).

2. Extrair, estabilizar e transportar núcleos de incremento no campo

1. Pegue uma furadeira sem fio equipada com um reforço de torque e um descaroçador de incremento, selecione a posição do descaroçador e coloque o descaroçador perpendicular ao eixo de crescimento da haste.
   NOTA: O mesmo pode ser feito manualmente usando o descaroçador de incremento sem furadeira sem fio.
2. Comece a retirar o núcleo até que o descaroçador atinja pelo menos metade do diâmetro do caule. Verifique a profundidade conforme explicado acima, segurando o extrator (que tem o mesmo comprimento do descaroçador) ao lado do descaroçador.
3. No caso de usar uma furadeira sem fio, retire a furadeira, coloque a alça no descaroçador (o que já acontece ao usar o descaroçador de incremento manualmente), pegue o extrator com o lado aberto voltado para cima e insira-o totalmente no descaroçador.
4. Gire o descaroçador de incremento para trás (uma volta completa) para quebrar o núcleo da haste. Retire o extrator, incluindo o núcleo.
5. Remova o núcleo do extrator. Verifique a direção da fibra do núcleo para garantir uma orientação vertical das fibras ao colocar o núcleo no suporte.
   NOTA: A direção da fibra pode ser verificada em ambas as extremidades do núcleo, bem como na lateral do núcleo. Para isso, segure o núcleo contra a luz e gire-o até que um lado brilhante seja visto. Isso acontece porque, deste lado, as paredes celulares radiais são cortadas longitudinalmente e refletem a luz de maneira diferente do resto do núcleo.
6. Coloque o núcleo em cima do suporte com a direção da fibra na vertical. Pressione a parte superior do núcleo com todos os dedos até que o núcleo deslize para dentro do suporte.
7. Etiquete o núcleo na lateral do suporte usando um lápis macio, permitindo escrever até mesmo no vidro.
   NOTA: A escrita pode ser removida posteriormente com uma borracha comum.
8. Coloque o suporte com o núcleo na caixa de transporte e feche a tampa.

3. Preparando os núcleos montados no laboratório

1. OPCIONAL: Incorporação dos núcleos montados em parafina para potencial microseccionamento.
   1. Coloque uma caixa de aço com tampa equipada com uma válvula para conexão de bomba de vácuo em uma placa de aquecimento, encha-a até aproximadamente 2 cm com parafina e espere até que derreta completamente.
   2. Retire os núcleos montados da caixa de transporte. Coloque os suportes com os núcleos como estão na parafina líquida e feche a tampa.
   3. Ligue a bomba de vácuo, aplique um vácuo constante e leve no recipiente e aguarde cerca de 2 h. Devido à estrutura aberta do suporte, a parafina pode penetrar nos núcleos sem barreiras adicionais.
   4. Pare a bomba de vácuo e abra a tampa. Retire os suportes com os núcleos, coloque-os em uma grade e deixe-os esfriar.
   5. Se necessário, remova o excesso de parafina das laterais do suporte.
2. Preparando as superfícies do núcleo
   1. Retire os núcleos montados da caixa de transporte ou do banho de parafina. Colocar o suporte com o núcleo tal como está no suporte de amostras de um micrótomo de núcleo. Certifique-se de orientar o núcleo de forma que a madeira tardia dos anéis fique voltada para a lâmina.
   2. Aperte os parafusos do sample suporte até que o suporte do núcleo esteja completamente seguro.
   3. Levante o porta-amostras até que o núcleo toque levemente na lâmina. Puxe a lâmina por toda a extensão do núcleo para cortar a primeira parte da parte superior.
   4. Empurre a faca para trás do núcleo, levante o porta-amostras alguns mícrons e repita o procedimento até obter uma superfície plana de pelo menos 2-3 mm de largura.
   5. Assim que a superfície for cortada conforme o esperado, remova o suporte do núcleo do porta-amostras do micrótomo.
      NOTA: Recomenda-se cortar os núcleos com um micrótomo central e não lixá-los porque a superfície é mais limpa e reta e as células não estão cheias de poeira.

4. Digitalizando as superfícies do núcleo

1. Coloque o suporte do núcleo com a superfície do núcleo liso na mesa de um sistema de captura de imagem, como o sistema WSL-Skippy é apresentado aqui.
2. Certifique-se de alinhar o suporte do núcleo com a direção de movimento da mesa ou câmera.
3. Posicione a mesa com o suporte do núcleo abaixo da câmera para ter o anel mais externo no centro da view abaixo da objetiva da câmera.
4. Coloque uma escala ao lado do início do núcleo e tire uma imagem para fins de calibração.
   NOTA: Isso só precisa ser feito uma vez ao fazer imagens de muitos núcleos em sucessão.
5. Defina o comprimento do núcleo no software e inicie o processo de captura de imagem. Quando a última imagem é tirada, a tabela volta para a posição inicial.
6. Remova a amostra da mesa, coloque o próximo suporte abaixo da câmera e repita o procedimento descrito anteriormente, definindo o comprimento do núcleo até que todos os núcleos sejam fotografados.
7. Use um software de costura (sem distorção), por exemplo, PTGui, para combinar as imagens únicas em uma imagem final da superfície do núcleo.

5. Armazenando os núcleos

1. Pegue os núcleos analisados no suporte e coloque-os no rack de armazenamento portátil impresso com uma impressora 3D.
2. Rotule o rack para identificar os núcleos do lado de fora.
3. Armazene o rack em uma prateleira ou em qualquer outro arquivo disponível.

Discussion

A inclusão da anatomia da madeira nos estudos dendroecológicos abriu amplamente esses estudos para novas e aprofundadas análises das condições ambientais passadas 28,29,30. Essas novas técnicas também intensificaram os esforços analíticos, ou seja, o tempo de laboratório necessário para gerar os dados de interesse. Houve inúmeras tentativas de otimizar o trabalho de laboratório e reduzir o tempo necessário no laboratório em relação às técnicas anatômicas da madeira 9,12,13,15,30. Mas quase nenhum esforço foi feito para facilitar o procedimento comum de manuseio, preparação e armazenamento de testemunhos para esses estudos.

A impressão 3D oferece novas possibilidades a esse respeito⁹. O novo suporte de núcleo impresso em 3D é a primeira tentativa de simplificar todo esse procedimento, tornando-o menos demorado e, para isso, mais eficiente.

Enquanto os núcleos armazenados em palhinhas de plástico^31,32 ou recipientes comparáveis têm de ser retirados para evitar que os fungos se desenvolvam no exterior (e em breve também no interior) do núcleo, os núcleos fixados nos suportes GSC podem permanecer como estão. Até este ponto, é comparável a armazená-los em canudos de papel³³.

A vantagem torna-se clara assim que todo o procedimento de (i) remover os núcleos da palha (ou outro recipiente), (ii) colá-los em suportes de madeira ou fixá-los em outros objetos como suportes de cabos, e (iii) o processo possivelmente propenso a erros de transferência do respectivo código usado para cada núcleo, pois era quase um padrão há décadas³⁴, torna-se desnecessário.

A estrutura aberta do suporte GSC permite armazenar os núcleos sem o risco de infestação fúngica, como seria o caso quando armazenado em um recipiente de plástico. Conforme descrito acima, o suporte também permite uma incorporação em parafina para estabilizar a estrutura. No entanto, essa incorporação "simples" não pode ser comparada aos procedimentos comuns de incorporação usando para incorporar a amostra em um bloco de parafina, como é feito para micro núcleos³⁵. A técnica simples é bastante comparável à aplicação de amido de milho no corte de micro seções³⁶. Isso estabilizará melhor as células e evitará que elas se quebrem durante o procedimento de corte, mas é mais demorado do que simplesmente adicionar amido de milho. Essa forma de incorporação não estabilizará todo o núcleo como se estivesse embutido em um bloco. Se o núcleo estiver quebrado, as seções também quebrarão. Como o suporte GSC se encaixa no micrótomo do núcleo³⁷, a preparação da superfície para o processo de digitalização subsequente leva apenas alguns minutos.

Para o processo de digitalização de anéis de árvores, a aplicação de scanners de mesa, freqüentemente usados para medições de intensidade de azul^38,39, não foi satisfatória em relação a visualizações mais detalhadas da estrutura do anel devido à qualidade bastante baixa das imagens resultantes. Embora os limites dos anéis comuns (largos) de coníferas fossem visíveis nessas imagens, anéis estreitos, ou mesmo flutuações de densidade, eram quase impossíveis de identificar.

Embora existam novas tentativas fascinantes de digitalizar anéis de árvores em alta resolução, como o raio-x CT⁴⁰, o uso de câmeras digitais com alta resolução ainda é a maneira mais eficiente e econômica de produzir imagens de alta qualidade para medições posteriores.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Core-microtome	WSL	https://www.wsl.ch/en/services-produkte/microtomes/	Microtome to cut micro sections from increment cores
Epson Expression 10000XL	EPSON	https://epson.com/Support/Scanners/Expression-Series/Epson-Expression-10000XL---Graphic-Arts/s/SPT_E10000XL-GA	flatbed scanner
GSC holder	WSL	in-house	3D printed mount to fix cores for transport, preparation, analyses, and storage
Skippy image capturing system	WSL	https://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/)	Image capturing system developed at WSL equiped with a 61 MP camera (Sony Alpha 7R IV and Sony FE 90mm f/2.8 Macro lens)