基于 MultiBac 系统的人肌球蛋白 7a 纯化和生物物理表征

肌球蛋白 7a 是一种基于肌动蛋白的运动蛋白，对听觉和视觉过程至关重要。肌球蛋白 7a 突变导致 1 型 Usher 综合征，这是人类最常见和最严重的聋盲形式。据推测，肌球蛋白 7a 与其他 Usher 蛋白形成跨膜粘附复合物，这对感光细胞和耳蜗毛细胞的结构功能完整性至关重要。然而，由于获得纯、完整蛋白质的挑战，人肌球蛋白 7a 的确切功能机制仍然难以捉摸，可用的结构和生物力学研究有限。最近的研究表明，哺乳动物肌球蛋白-7a 是一种多聚体运动复合物，由一条重链和三种类型的轻链组成：调节轻链 （RLC）、钙调蛋白和钙调蛋白样蛋白 4 （CALML4）。与钙调蛋白不同，CALML4 不与钙离子结合。钙敏感和不敏感的钙调蛋白对于哺乳动物肌球蛋白 7a 的适当微调其机械性能都至关重要。在这里，我们描述了一种使用 MultiBac 杆状病毒蛋白表达系统生产重组人肌球蛋白 7a 全酶的详细方法。这产生了毫克级的高纯度全长蛋白，可用于其生化和生物物理表征。我们进一步提出了一种方案，用于使用定制的 体外 运动测定和荧光显微镜评估其机械和运动特性。完整的人肌球蛋白 7a 蛋白的可用性，以及此处描述的详细功能表征方案，为进一步研究肌球蛋白 7a 在视觉和听觉中的分子方面铺平了道路。