Wir danken der Microscopy Imaging Facility und dem Visual Function and Morphology Core an der West Virginia University für die Diskussion und Hilfe bei der Bildanalyse. Diese Arbeit wird durch die Tenure-Track-Startup-Fonds der West Virginia University School of Medicine bis R.L. unterstützt. Diese Arbeit wird auch vom Visual Sciences Center of Biomedical Research Excellence (Vs-CoBRE) des National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) (P20GM144230) und dem NIGMS West Virginia Network of Biomedical Research Excellence (WV-INBRE) (P20GM103434) unterstützt.

HINWEIS: Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Synthese des intakten humanen Myosin-7a-Holoenzyms und zur Charakterisierung seiner Motilität in vitro. Dieses Protokoll ist in drei Abschnitte unterteilt: erstens die Expression des humanen Myosin-7a unter Verwendung des MultiBac-Baculovirus-Proteinexpressionssystems; Zweitens, getrennte Reinigung von Myosin-7a-Leichtketten unter Verwendung des E.coli His6-SUMO-Systems; und schließlich die Untersuchung der Motilität von humanem Myosin-7a mit dem Aktin-Filament-...

Rekombinantes humanes Myosin-7a-Produktions- und Funktionscharakterisierungsprotokoll

Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von rekombinantem humanem Myosin-7a-Protein aus Insektenzellen vorgestellt. Obwohl das Sf9/Baculovirus-System zur Herstellung einer Vielzahl von Myosinen verwendet wurde 40,41,42,43, wurde das Säugetier-Myosin-7a erst vor kurzem erfolgreich mit dem MultiBac-Baculovirus-System gereinigt 14. Es wurde festgestellt,...

Myosine sind molekulare Motorproteine, die mit Aktin interagieren, um zahlreiche zelluläre Prozesse anzutreiben 1,2,3,4. Der Mensch besitzt 12 Klassen und 39 Myosin-Gene5, die an einer Vielzahl physiologischer Funktionen beteiligt sind, wie z. B. der Muskelkontraktion6 und sensorischen Prozessen7. Jedes Myosinmolekül ist ein multimerer Komplex, der aus einer schweren Kette und leichten Ketten besteht. Die schwere Kette ist in Kopf-, Hals- und Schwanzbereich unterteilt. Der Kopf enthält Aktin- und Nukleotid-Bindungsstellen, die für die ATP-Hydrolyse und die Erzeugung von Kraft auf Aktinfilamenteverantwortlich sind 2. Den Hals bilden mehrere α-helikale IQ-Motive, an die ein bestimmter Satz von Lichtketten gebunden ist. Zusammen fungieren sie als Hebelarm, um die Konformationsänderungen des Motors zu großen Bewegungen zu verstärken 8,9,10. Der Schwanz enthält klassenspezifische Subdomänen und spielt eine regulatorische Rolle bei der Abstimmung der motorischen Aktivität von Myosin und der Vermittlung von Interaktionen mit zellulären Bindungspartnern 2,11.
Humanes Myosin-7a, ein Mitglied der Myosine der Klasse 7, ist essentiell für auditive und visuelle Prozesse 12,13. Die IQ-Motive von humanem Myosin-7a sind mit einer einzigartigen Kombination von Leichtketten assoziiert, einschließlich der regulatorischen Leichtkette (RLC), Calmodulin und Calmodulin-like Protein 4 (CALML4)14,15,16. Neben der Stabilisierung des Hebelarms regulieren diese leichten Ketten die mechanischen Eigenschaften von Myosin-7a als Reaktion auf den Kalzium-Signalweg, eine Eigenschaft, die nur für die Säugetier-Isoform14 zu gelten scheint.
Defekte im Gen, das für die Myosin-7a-Schwerkette (MYO7A/USH1B) kodiert, sind für das Usher-Syndrom Typ 1 verantwortlich, die schwerste Form des kombinierten Seh- und Hörverlusts beim Menschen17. Darüber hinaus gehört das Leichtketten-Gen CALML4 zu den Kandidatengenen, die das ursächliche Allel für USH1H, eine weitere Variante des Typ-1-Usher-Syndroms, enthalten15,18. In der Netzhaut wird Myosin-7a im retinalen Pigmentepithel und in den Photorezeptorzellenexprimiert 13. Es wurde mit der Lokalisation von Melanosomen im retinalen Pigmentepithel (RPE)19 und der Phagozytose von Photorezeptorscheiben des äußeren Segments durch die RPE-Zellen in Verbindung gebracht20. Im Innenohr kommt Myosin-7a hauptsächlich in den Stereozilien vor, wo es eine entscheidende Rolle bei der Etablierung von Haarbündeln und bei der Steuerung des mechanoelektrischen Transduktionsprozesses spielt 12,21,22.
Während die Bedeutung von Myosin-7a in Sinneszellen gut bekannt ist, sind seine Funktionsmechanismen auf molekularer Ebene noch wenig verstanden. Diese Wissenslücke ist zum Teil auf die Herausforderungen bei der Reinigung des intakten Proteins, insbesondere der Säugetier-Isoform, zurückzuführen. In jüngster Zeit wurden erhebliche Fortschritte bei der Verwendung des MultiBac-Systems zur rekombinanten Expression des vollständigen humanen Myosin-7a-Holoenzyms14 erzielt. Dieser Fortschritt hat strukturelle und biophysikalische Charakterisierungen dieses Motorproteins ermöglicht, was zur Entdeckung mehrerer einzigartiger Eigenschaften von humanem Myosin-7a führte, die speziell für die Hörfunktionen von Säugetieren angepasst sind14,23.
Das MultiBac-System ist eine fortschrittliche Baculovirus/Insektenzell-Plattform, die speziell für die Expression eukaryotischer multimerer Komplexe entwickelt wurde 24,25. Ein Hauptmerkmal dieses Systems ist seine Fähigkeit, mehrere Genexpressionskassetten, die jeweils für eine Untereinheit des Komplexes kodieren, in einem einzigen MultiBac-Baculovirus zu beherbergen. Der Aufbau der Multigen-Expressionskassetten wird durch ein sogenanntes Multiplikationsmodul erleichtert: eine Homing-Endonuklease (HE)-Stelle und eine passend gestaltete BstXI-Stelle, die die multiplen Klonierungsstellen (MCS) flankiert. Dieses Modul ermöglicht die iterative Assemblierung einer einzelnen Expressionskassette durch Restriktion/Ligation, wobei die Tatsache genutzt wird, dass die HE- und BstXI-Restriktionsstellen bei ihrer Ligation eliminiert werden. In dieser Arbeit werden humane Myosin-7a-Schwerketten, RLC, Calmodulin und CALML4 jeweils in das Multiplikationsmodul innerhalb des pACEBac1-Vektors kloniert (Abbildung 1A), die dann durch den iterativen Prozess zu einer Multigenexpressionskassette zusammengesetzt werden (Abbildung 1B). Die Myosin-7a-Multigenkassette wird durch die Transposition des mini-Tn7-Elements vom pACEBac1-Vektor zur mini-attTn7-Zielstelle im Genom in das bakulovirale Genom (Bacmid) integriert (Abbildung 1C). Nach Verfahren zur Bacmid-Aufreinigung, Baculovirus-Produktion und Amplifikation (Abbildung 1D,E) wird das rekombinante Myosin-7a-MultiBac-Baculovirus hergestellt und kann für die Proteinproduktion in großem Maßstab verwendet werden (Abbildung 1F). Zusätzlich können die Myosin-7a-Leichtketten separat in E. coli hergestellt und mit einem spaltbaren His6-SUMO-Tag 26,27,28 gereinigt werden. Die gereinigten Leichtketten sind nützlich, um ihre Bindungsdynamik und Regulation von Myosin-7a zu untersuchen.
Das gereinigte Myosin-7a-Protein kann strukturellen, biochemischen und biophysikalischen Studien unterzogen werden, um Einblicke in die strukturell-funktionelle Regulation dieses Motorproteins zu gewinnen. Darüber hinaus können seine Wechselwirkungen mit dem Aktinnetzwerk und anderen Bindungsproteinen29 mit einer Vielzahl von in vitro Rekonstitutionsansätzen untersucht werden. Die Erkenntnisse aus diesen Analysen werden die biophysikalischen Eigenschaften dieses Myosins beeinflussen und zu einem mechanistischen Verständnis führen, wie Myosin-7a die Veränderungen des Zytoskeletts antreibt und letztendlich die einzigartige Morphologie und Funktion von Sinneszellen prägt. In diesem Artikel beschreiben wir einen Arbeitsablauf für den Aktin-Filament-Gleittest, der speziell für Myosin-7a bei Säugetieren angepasst wurde. Der Aktin-Filament-Gleit-Assay ist ein robuster In-vitro-Motilitätsassay, der die Bewegung von fluoreszierenden Aktinfilamenten quantitativ untersucht, die von einer großen Anzahl von Myosinmotoren angetrieben werden, die auf einer Deckglasoberfläche immobilisiert sind 30,31,32. Zu den Vorteilen dieses Assays gehören die einfache Einrichtung, der minimale Gerätebedarf (ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit Digitalkamera) und die hohe Reproduzierbarkeit. Da die Bewegung der Aktinfilamente von einem Cluster immobilisierter Myosinmotoren angetrieben wird, ist dieser Assay besonders nützlich für die Untersuchung der Motilität von monomeren Myosinen wie Myosin-7a14,33. Die Protokolle umfassen mehrere Modifikationen, von experimentellen Verfahren bis hin zu bildgebenden Analysen, die speziell auf die einzigartigen beweglichen Eigenschaften von Säugetier-Myosin-7a zugeschnitten sind. Mit der Verfügbarkeit eines intakten Myosin-7a-Proteins und dem hier skizzierten funktionellen Charakterisierungsprotokoll legt diese Arbeit den Grundstein für weitere Untersuchungen der molekularen Rolle von Myosin-7a sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Prozessen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X FLAG Peptide</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x22mm No. 1.5 coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>376814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Vented Erlenmyer Shaker Flask</td>
			<td>IntelixBio</td>
			<td>DBJ-SF250VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75x25x1 mm Vistavision microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin Protein (&#62;99% Pure)</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Spin Disposable Chromatography Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluo-Gal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstXI Enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0113S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>208694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Champion pET-SUMO Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>K30001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutsmart Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B6004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>DO632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>DO632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-610-304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Sided Tape</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>909955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP2818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExpiFectamine Sf Transfection Reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAST program</td>
			<td>http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Model 505 Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB505110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td>10 mg/mL in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Cobalt Resin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>89966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-CeuI Enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0699S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Stabilizer Plugin</td>
			<td>https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ FIJI</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji/Downloads</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion Snap Assembly Master Mix</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>638948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15529019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451SK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ67354AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Orifice Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-134</td>
			<td>1-200uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar, Ready-Made Powder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>J75851-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>78435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>J61014.=E</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>J61014.=E</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max Efficiency DH10Bac Competent Cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10361012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 1.7mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 1.7mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 1.7mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100X TIRF objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>ORCA-Fusion BT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Laser Unit</td>
			<td>Andor iXon Ultra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miller&#39;s LB Broth</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-050-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E.coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2987H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer r3.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B6003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>LADD Research Industries</td>
			<td>53152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACEBac1 Vector</td>
			<td>Geneva Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>78830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNase A (20 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (50)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick CIP</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0525S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SENP2 protease</td>
			<td></td>
			<td>PMID:17591783</td>
			<td>Purified in the lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11496015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf-900 III SFM (1X) - Serum Free Media Complete</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer G3 Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 3 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A52971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick Release Vacuum Driven Disposable Filtration System</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29148721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Buffer - 10X with 10mM ATP</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T7660-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multibac system-based purification and biophysical characterization of human myosin-7a

Myosin-7a ist ein auf Aktin basierendes Motorprotein, das für auditive und visuelle Prozesse unerlässlich ist. Mutationen in Myosin-7a führen zum Usher-Syndrom Typ 1, der häufigsten und schwersten Form der Taubblindheit beim Menschen. Es wird angenommen, dass Myosin-7a mit anderen Usher-Proteinen einen Transmembran-Adhäsionskomplex bildet, der für die strukturell-funktionelle Integrität von Photorezeptor- und Cochlea-Haarzellen essentiell ist. Aufgrund der Herausforderungen bei der Gewinnung von reinem, intaktem Protein sind die genauen Funktionsmechanismen von humanem Myosin-7a jedoch nach wie vor schwer fassbar, da nur begrenzte strukturelle und biomechanische Studien verfügbar sind. Neuere Studien haben gezeigt, dass Myosin-7a bei Säugetieren ein multimerer Motorkomplex ist, der aus einer schweren Kette und drei Arten von leichten Ketten besteht: regulatorische leichte Kette (RLC), Calmodulin und Calmodulin-ähnliches Protein 4 (CALML4). Im Gegensatz zu Calmodulin bindet CALML4 nicht an Calciumionen. Sowohl die kalziumempfindlichen als auch die unempfindlichen Calmoduline sind für das Myosin-7a von Säugetieren entscheidend für die richtige Feinabstimmung seiner mechanischen Eigenschaften. Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Herstellung von rekombinanten humanen Myosin-7a-Holoenzymen unter Verwendung des MultiBac Baculovirus-Proteinexpressionssystems. Dies ergibt Milligrammmengen an hochreinem Protein in voller Länge, was seine biochemische und biophysikalische Charakterisierung ermöglicht. Darüber hinaus stellen wir ein Protokoll zur Bewertung seiner mechanischen und beweglichen Eigenschaften mit Hilfe von maßgeschneiderten in vitro Motilitätsassays und Fluoreszenzmikroskopie vor. Die Verfügbarkeit des intakten humanen Myosin-7a-Proteins sowie das hier beschriebene detaillierte funktionelle Charakterisierungsprotokoll ebnen den Weg für weitere Untersuchungen der molekularen Aspekte von Myosin-7a im Sehen und Hören.

Myosins are molecular motor proteins that interact with actin to drive numerous cellular processes1,2,3,4. Humans possess 12 classes and 39 myosin genes5, which are involved in a wide range of physiological functions, such as muscle contraction6 and sensory processes7. Each myosin molecule is a multimeric complex composed of a heavy chain and light chains. The heavy chain is divided into head, neck, and tail regions. The head contains actin- and nucleotide-binding sites that are responsible for ATP hydrolysis and generating force on actin filaments2. The neck is formed by several &#945;-helical IQ motifs where a specific set of light chains are bound. They together function as a lever arm to amplify the motor&#39;s conformational changes into large movements8,9,10. The tail contains class-specific subdomains and plays a regulatory role in tuning myosin&#39;s motor activity and mediating interactions with cellular binding partners2,11.
Human myosin-7a, a member of class-7 myosins, is essential for auditory and visual processes12,13. The IQ motifs of human myosin-7a are associated with a unique combination of light chains, including the regulatory light chain (RLC), calmodulin, and calmodulin-like protein 4 (CALML4)14,15,16. Besides stabilizing the lever arm, these light chains regulate the mechanical properties of myosin-7a in response to calcium signaling, a feature that appears to be unique to the mammalian isoform14.
Defects in the gene encoding the myosin-7a heavy chain (MYO7A/USH1B) are responsible for Usher syndrome type 1, the most severe form of combined vision and hearing loss in humans17. Additionally, the light chain gene CALML4, is among the candidate genes mapped to contain the causative allele for USH1H, another variant of type 1 Usher syndrome15,18. In the retina, myosin-7a is expressed in the retinal pigment epithelium and photoreceptor cells13. It has been implicated in the localization of melanosomes in the retinal pigment epithelium (RPE)19 and phagocytosis of photoreceptor outer segment disks by the RPE cells20. In the inner ear, myosin-7a is primarily found in the stereocilia, where it plays a critical role in establishing hair bundles and in gating the mechano-electrical transduction process12,21,22.
While the importance of myosin-7a in sensory cells is well established, its functional mechanisms at the molecular level remain poorly understood. This gap in knowledge is partly due to the challenges in purifying the intact protein, especially the mammalian isoform. Recently, significant progress has been made using the MultiBac system to recombinantly express the complete human myosin-7a holoenzyme14. This advancement has enabled structural and biophysical characterizations of this motor protein, leading to the discovery of several unique properties of human myosin-7a that are specifically adapted for mammalian auditory functions14,23.
The MultiBac system is an advanced baculovirus/insect cell platform specifically designed for the expression of eukaryotic multimeric complexes24,25. A key feature of this system is its ability to host multiple gene expression cassettes, each encoding a subunit of the complex, within a single MultiBac baculovirus. The assembly of the multigene expression cassettes is facilitated through a so-called multiplication module: a homing endonuclease (HE) site and a matching designed BstXI site flanking the multiple cloning sites (MCS). This module enables the iterative assembly of a single expression cassette by restriction/ligation, leveraging the fact that the HE and BstXI restriction sites are eliminated upon their ligation. In this paper, human myosin-7a heavy chain, RLC, calmodulin, and CALML4 are each cloned into the multiplication module within the pACEBac1 vector (Figure 1A), which are then assembled into a multigene expression cassette through the iterative process (Figure 1B). The myosin-7a multigene cassette is integrated into the baculoviral genome (bacmid) through the transposition of the mini-Tn7 element from the pACEBac1 vector to the mini-attTn7 target site in the genome (Figure 1C). Following procedures for bacmid purification, baculovirus production, and amplification (Figure 1D,E), the recombinant myosin-7a MultiBac baculovirus is prepared and can be used for large-scale protein production (Figure 1F). Additionally, the myosin-7a light chains can be produced separately in E. coli and purified using a cleavable His6-SUMO tag26,27,28. The purified light chains are useful for studying their binding dynamics and regulation of myosin-7a.
The purified myosin-7a protein can be subjected to structural, biochemical, and biophysical studies to gain insights into the structural-functional regulation of this motor protein. Additionally, its interactions with the actin network and other binding proteins29 can be examined using a variety of in vitro reconstitution approaches. Findings from these analyses will inform the biophysical properties of this myosin, leading to a mechanistic understanding of how myosin-7a drives the cytoskeletal changes and ultimately shapes the unique morphology and function of sensory cells. In this paper, we detail a workflow for actin filament gliding assay that has been specifically adapted for mammalian myosin-7a. Actin filament gliding assay is a robust in vitro motility assay that quantitatively studies the movement of fluorescent actin filaments propelled by a large number of myosin motors immobilized on a coverslip surface30,31,32. The advantages of this assay include its simplicity of setup, minimal equipment requirements (a wide-field fluorescence microscope equipped with a digital camera), and high reproducibility. Additionally, because the motion of actin filaments is driven by a cluster of immobilized myosin motors, this assay is particularly useful for studying the motility of monomeric myosins such as myosin-7a14,33. The protocols include several modifications, from experimental procedures to imaging analysis, specifically tailored to the unique motile properties of mammalian myosin-7a. With the availability of intact myosin-7a protein and the functional characterization protocol outlined here, this paper lays the groundwork for further investigation into the molecular roles of myosin-7a in both physiological and pathological processes.

Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Rolle von Myosin-7a und Usher-Proteinen bei Hör- und menschlichen Krankheiten

MultiBac-Systembasierte Aufreinigung und biophysikalische Charakterisierung von humanem Myosin-7a

Der gereinigte Myosin-7a-Komplex und die Leichtkettenproteine können mittels SDS-PAGE-Gelelektrophorese ausgewertet werden, wie in Abbildung 3 gezeigt. Die Bande oberhalb des 200 kDa-Markers entspricht der Myosin-7a-Schwerkette (255 kDa). Die drei Banden, die zwischen den 22- und 14-kDa-Markern von oben nach unten wandern, sind RLC (20 kDa), Calmodulin bzw. CALML4. Während Calmodulin und CALML4 ein ähnliches Molekulargewicht von etwa 17 kDa haben, können die beiden Proteine mit einem 16%...

Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur rekombinanten Herstellung des humanen Myosin-7a-Holoenzyms unter Verwendung des MultiBac-Baculovirus-Systems und zur Untersuchung seiner Motilität unter Verwendung eines maßgeschneiderten In-vitro-Filament-Gliding-Assays.

Myosin-7a is an actin-based motor protein vital for auditory and visual processes. Mutations in myosin-7a lead to Usher syndrome type 1, the most common ...

multibac-system-based-purification-biophysical-characterization-human

MultiBac-Systembasierte Aufreinigung und biophysikalische Charakterisierung von humanem Myosin-7a

Abstract