Purificazione basata sul sistema MultiBac e caratterizzazione biofisica della miosina-7a umana

La miosina-7a è una proteina motoria a base di actina vitale per i processi uditivi e visivi. Le mutazioni della miosina-7a portano alla sindrome di Usher di tipo 1, la forma più comune e grave di sordocecità nell'uomo. Si ipotizza che la miosina-7a formi un complesso di adesione transmembrana con altre proteine di Usher, essenziali per l'integrità strutturale-funzionale dei fotorecettori e delle cellule ciliate cocleari. Tuttavia, a causa delle sfide nell'ottenere proteine pure e intatte, gli esatti meccanismi funzionali della miosina-7a umana rimangono sfuggenti, con studi strutturali e biomeccanici limitati disponibili. Studi recenti hanno dimostrato che la miosina-7a dei mammiferi è un complesso motorio multimerico costituito da una catena pesante e tre tipi di catene leggere: catena leggera regolatoria (RLC), calmodulina e proteina 4 simile alla calmodulina (CALML4). A differenza della calmodulina, CALML4 non si lega agli ioni calcio. Sia le calmoduline sensibili al calcio che quelle insensibili sono fondamentali per la miosina-7a dei mammiferi per una corretta messa a punto delle sue proprietà meccaniche. Qui, descriviamo un metodo dettagliato per produrre l'oloenzima ricombinante della miosina-7a umana utilizzando il sistema di espressione proteica MultiBac Baculovirus. Ciò produce quantità di milligrammi di proteina a lunghezza intera di elevata purezza, consentendone la caratterizzazione biochimica e biofisica. Presentiamo inoltre un protocollo per valutarne le proprietà meccaniche e mobili utilizzando saggi di motilità in vitro su misura e microscopia a fluorescenza. La disponibilità della proteina miosina-7a umana intatta, insieme al dettagliato protocollo di caratterizzazione funzionale qui descritto, apre la strada a ulteriori indagini sugli aspetti molecolari della miosina-7a nella vista e nell'udito.