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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

在这里,我们介绍了热位移测定,这是一种基于荧光的高通量技术,用于研究小分子与目标蛋白质的结合。

Abstract

定义功能未知的蛋白质的生物学重要性对理解细胞过程构成了重大障碍。尽管生物信息学和结构预测有助于未知蛋白质的研究,但 体外 实验验证经常受到生化活性所需的最佳条件和辅因子的阻碍。辅因子结合不仅对某些酶的活性至关重要,而且还可能增强蛋白质的热稳定性。这种现象的一个实际应用在于利用热稳定性的变化(通过蛋白质熔解温度的变化来衡量)来探测配体结合。

热位移测定 (TSA) 可用于分析不同配体与目标蛋白质的结合,或找到稳定条件以进行 X 射线晶体学等实验。在这里,我们将描述一种利用假激酶硒蛋白 O (SelO) 的 TSA 方案,用于一种用于测试金属和核苷酸结合的简单且高通量的方法。与经典激酶相反,SelO 以倒置方向结合 ATP,以催化 AMP 在称为蛋白质 AMPylation 的翻译后修饰中将 AMP 转移到蛋白质的羟基侧链。通过利用熔解温度的变化,我们提供了对 SelO 功能背后的分子相互作用的重要见解。

Introduction

许多人类蛋白质组的表征仍然很差。Dunham 和 Kustatscher 等人描述的“路灯效应”是指广泛研究的蛋白质受到更多关注而忽视研究不足的蛋白质的现象 1,2。导致这种效果的因素包括某些蛋白质的生物学重要性和疾病相关性。此外,提供基础知识的先前研究以及功能分析工具的可用性进一步刺激了对高度研究的蛋白质的研究 1,2。Understudy Proteins Initiative、Structural Genomics Consortium 和 Enzyme Function Initiative 等项目旨在使用结构和功能蛋白质组学来表征研究不足的蛋白质 2,3,4。鉴定研究不足的蛋白质的分子功能的补充方法是检查这些蛋白质与小分子的相互作用,以获得对调节和底物特异性的宝贵见解。

小分子的结合可以增加蛋白质的热稳定性5.这种现象称为配体诱导的构象....

Protocol

1. 实验设置

  1. 使用可以检测荧光的热循环仪(例如 RT-PCR 仪器)执行所述方案。如果使用 SYPRO Orange,如本协议所述,请使用允许 470 nm 左右激发和 570 nm 附近发射检测的扫描模式。对热循环仪进行编程,使样品在 20 °C 下保持 2 分钟,然后将温度升高 0.5 °C/1 分钟至 95 °C;每 1 °C 测量一次荧光强度。
    注:我们建议在循环结束时执行一个可选步骤,将样?.......

Representative Results

真核生物 SelO 由一个 N 末端线粒体靶向序列、一个激酶样结构域和位于蛋白质 C 端的高度保守的硒代半胱氨酸组成23。这种线粒体驻留酶编码一个假激酶结构域,该结构域从细菌到人类都是保守的23。来自丁香假单胞菌的 SelO 同源物的结构分析揭示了活性位点的氨基酸改变,与经典激酶相比,这些改变促进了 ATP 以倒置方向结合

Discussion

热位移测定 (TSA) 是筛选蛋白质-配体相互作用的有效方法,包括与辅因子和抑制剂的相互作用。在该方案中,我们使用 TSA 来测量假激酶 SelO 与核苷酸和二价阳离子的结合。我们的研究结果表明,SelO 在 ATP 和 Mg2+/Mn2+ 存在下表现出更高的热稳定性。这一观察结果与之前的报告一致,表明来自大肠杆菌、酿酒酵母智人的 SelO 同源物催化 AMP ?.......

Disclosures

作者声明没有利益冲突。

Acknowledgements

A.S. 是 W.W. Caruth, Jr. 生物医学研究学者、德克萨斯州癌症预防和研究所 (CPRIT) 学者,以及 Charles 和 Jane Pak 矿物代谢中心和临床研究教师学者。这项工作得到了 NIH Grant K01DK123194 (AS)、CPRIT Grant RR190106 (AS)、Welch (I-2046-20200401) 和 Welch (I-2046-20230405) 的支持。

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigma AldrichA2383-10Gused for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assemblyBeckman CoulterC19416
CFX Opus 384 Real-time PCR systemBio-Rad12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/whiteBio-RadHSP3805
Magnesium ChlorideSigma AldrichM8266-100Gused for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrateSigma AldrichM3634-500Gused for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, opticalBio-RadMSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stainSigma AldrichS5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrateSigma AldrichU6625-100MGused for representative results but not required to perfom TSA

References

  1. Dunham, I. Human genes: Time to follow the roads less traveled. PLoS Biol. 16 (9), e3000034 (2018).
  2. Kustatscher, G., et al. An open invitation to the understudied proteins initiative. Nat Biotechnol.

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