利用 Thermal Shift 分析探测底物与 Selenoprotein O 的结合

Summary

在这里，我们介绍了热位移测定，这是一种基于荧光的高通量技术，用于研究小分子与目标蛋白质的结合。

Abstract

定义功能未知的蛋白质的生物学重要性对理解细胞过程构成了重大障碍。尽管生物信息学和结构预测有助于未知蛋白质的研究，但 体外 实验验证经常受到生化活性所需的最佳条件和辅因子的阻碍。辅因子结合不仅对某些酶的活性至关重要，而且还可能增强蛋白质的热稳定性。这种现象的一个实际应用在于利用热稳定性的变化（通过蛋白质熔解温度的变化来衡量）来探测配体结合。

热位移测定 （TSA） 可用于分析不同配体与目标蛋白质的结合，或找到稳定条件以进行 X 射线晶体学等实验。在这里，我们将描述一种利用假激酶硒蛋白 O （SelO） 的 TSA 方案，用于一种用于测试金属和核苷酸结合的简单且高通量的方法。与经典激酶相反，SelO 以倒置方向结合 ATP，以催化 AMP 在称为蛋白质 AMPylation 的翻译后修饰中将 AMP 转移到蛋白质的羟基侧链。通过利用熔解温度的变化，我们提供了对 SelO 功能背后的分子相互作用的重要见解。

Introduction

许多人类蛋白质组的表征仍然很差。Dunham 和 Kustatscher 等人描述的“路灯效应”是指广泛研究的蛋白质受到更多关注而忽视研究不足的蛋白质的现象 ^1,2。导致这种效果的因素包括某些蛋白质的生物学重要性和疾病相关性。此外，提供基础知识的先前研究以及功能分析工具的可用性进一步刺激了对高度研究的蛋白质的研究 ^1,2。Understudy Proteins Initiative、Structural Genomics Consortium 和 Enzyme Function Initiative 等项目旨在使用结构和功能蛋白质组学来表征研究不足的蛋白质 ^2,3,4。鉴定研究不足的蛋白质的分子功能的补充方法是检查这些蛋白质与小分子的相互作用，以获得对调节和底物特异性的宝贵见解。

小分子的结合可以增加蛋白质的热稳定性⁵.这种现象称为配体诱导的构象....

Protocol

1. 实验设置

1. 使用可以检测荧光的热循环仪（例如 RT-PCR 仪器）执行所述方案。如果使用 SYPRO Orange，如本协议所述，请使用允许 470 nm 左右激发和 570 nm 附近发射检测的扫描模式。对热循环仪进行编程，使样品在 20 °C 下保持 2 分钟，然后将温度升高 0.5 °C/1 分钟至 95 °C;每 1 °C 测量一次荧光强度。
   注：我们建议在循环结束时执行一个可选步骤，将样?.......

Discussion

热位移测定 （TSA） 是筛选蛋白质-配体相互作用的有效方法，包括与辅因子和抑制剂的相互作用。在该方案中，我们使用 TSA 来测量假激酶 SelO 与核苷酸和二价阳离子的结合。我们的研究结果表明，SelO 在 ATP 和 Mg²⁺/Mn²⁺ 存在下表现出更高的热稳定性。这一观察结果与之前的报告一致，表明来自大肠杆菌、酿酒酵母和智人的 SelO 同源物催化 AMP ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma Aldrich	A2383-10G	used for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assembly	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR system	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-Rad	HSP3805
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G	used for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	M3634-500G	used for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma Aldrich	U6625-100MG	used for representative results but not required to perfom TSA