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Aqui, apresentamos o ensaio de deslocamento térmico, uma técnica baseada em fluorescência de alto rendimento usada para investigar a ligação de pequenas moléculas a proteínas de interesse.
Definir a importância biológica de proteínas com funções desconhecidas representa um obstáculo significativo na compreensão dos processos celulares. Embora as previsões bioinformáticas e estruturais tenham contribuído para o estudo de proteínas desconhecidas, as validações experimentais in vitro são frequentemente dificultadas pelas condições ideais e cofatores necessários para a atividade bioquímica. A ligação ao cofator não é apenas essencial para a atividade de algumas enzimas, mas também pode aumentar a estabilidade térmica da proteína. Uma aplicação prática desse fenômeno reside na utilização da mudança na estabilidade térmica, medida por alterações na temperatura de fusão da proteína, para sondar a ligação do ligante.
O ensaio de deslocamento térmico (TSA) pode ser usado para analisar a ligação de diferentes ligantes à proteína de interesse ou encontrar uma condição estabilizadora para realizar experimentos como cristalografia de raios-X. Aqui, descreveremos um protocolo para TSA utilizando a pseudoquinase, Selenoproteína O (SelO), para um método simples e de alto rendimento para testar a ligação de metais e nucleotídeos. Em contraste com as quinases canônicas, o SelO se liga ao ATP em uma orientação invertida para catalisar a transferência de AMP para as cadeias laterais de hidroxila das proteínas em uma modificação pós-traducional conhecida como AMPilação da proteína. Ao alavancar a mudança nas temperaturas de fusão, fornecemos informações cruciais sobre as interações moleculares subjacentes à função do SelO.
Grande parte do proteoma humano permanece mal caracterizado. O "efeito de iluminação pública" descrito por Dunham e Kustatscher et al. refere-se ao fenômeno em que proteínas extensivamente pesquisadas recebem mais atenção, deixando as proteínas pouco estudadas negligenciadas 1,2. Os fatores que contribuem para esse efeito incluem a importância biológica e a relevância da doença de certas proteínas. Além disso, pesquisas prévias que oferecem conhecimento fundamental, bem como a disponibilidade de ferramentas para análise funcional, estimulam ainda mais a pesquisa sobre
1. Configuração experimental
O SelO eucariótico consiste em uma sequência de direcionamento mitocondrial N-terminal, um domínio semelhante à quinase e uma selenocisteína altamente conservada no terminal C da proteína23. Esta enzima residente mitocondrial codifica um domínio pseudoquinase que é conservado de bactérias para humanos23. A análise estrutural do homólogo SelO de Pseudomonas syringae revelou alterações de aminoácidos no sítio ativo que.......
O Thermal Shift Assay (TSA) serve como um método eficiente para rastrear interações proteína-ligante, incluindo aquelas com cofatores e inibidores. Neste protocolo, usamos TSA para medir a ligação da pseudoquinase SelO a nucleotídeos e cátions divalentes. Nossos achados mostram que o SelO exibe maior estabilidade térmica na presença de ATP e Mg2+/Mn2+. Esta observação se alinha com relatórios anteriores indicando que homólogos SelO de E. coli, S. c.......
A.S. é bolsista W.W. Caruth, Jr. em Pesquisa Biomédica, bolsista do Instituto de Pesquisa e Prevenção do Câncer do Texas (CPRIT) e bolsista do corpo docente do Centro Charles e Jane Pak de Metabolismo Mineral e Pesquisa Clínica. Este trabalho foi apoiado pelo NIH Grant K01DK123194 (AS), CPRIT Grant RR190106 (AS), Welch (I-2046-20200401) e Welch (I-2046-20230405).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | A2383-10G | used for representative results but not required to perfom TSA |
Avanti J-15R with microplate carrier assembly | Beckman Coulter | C19416 | |
CFX Opus 384 Real-time PCR system | Bio-Rad | 12011452 | |
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-Rad | HSP3805 | |
Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266-100G | used for representative results but not required to perfom TSA |
Manganese (II) chloride tetrahydrate | Sigma Aldrich | M3634-500G | used for representative results but not required to perfom TSA |
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | |
SYPRO Orange Protein Gel stain | Sigma Aldrich | S5692-500UL | |
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate | Sigma Aldrich | U6625-100MG | used for representative results but not required to perfom TSA |
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