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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Aqui, apresentamos o ensaio de deslocamento térmico, uma técnica baseada em fluorescência de alto rendimento usada para investigar a ligação de pequenas moléculas a proteínas de interesse.

Abstract

Definir a importância biológica de proteínas com funções desconhecidas representa um obstáculo significativo na compreensão dos processos celulares. Embora as previsões bioinformáticas e estruturais tenham contribuído para o estudo de proteínas desconhecidas, as validações experimentais in vitro são frequentemente dificultadas pelas condições ideais e cofatores necessários para a atividade bioquímica. A ligação ao cofator não é apenas essencial para a atividade de algumas enzimas, mas também pode aumentar a estabilidade térmica da proteína. Uma aplicação prática desse fenômeno reside na utilização da mudança na estabilidade térmica, medida por alterações na temperatura de fusão da proteína, para sondar a ligação do ligante.

O ensaio de deslocamento térmico (TSA) pode ser usado para analisar a ligação de diferentes ligantes à proteína de interesse ou encontrar uma condição estabilizadora para realizar experimentos como cristalografia de raios-X. Aqui, descreveremos um protocolo para TSA utilizando a pseudoquinase, Selenoproteína O (SelO), para um método simples e de alto rendimento para testar a ligação de metais e nucleotídeos. Em contraste com as quinases canônicas, o SelO se liga ao ATP em uma orientação invertida para catalisar a transferência de AMP para as cadeias laterais de hidroxila das proteínas em uma modificação pós-traducional conhecida como AMPilação da proteína. Ao alavancar a mudança nas temperaturas de fusão, fornecemos informações cruciais sobre as interações moleculares subjacentes à função do SelO.

Introduction

Grande parte do proteoma humano permanece mal caracterizado. O "efeito de iluminação pública" descrito por Dunham e Kustatscher et al. refere-se ao fenômeno em que proteínas extensivamente pesquisadas recebem mais atenção, deixando as proteínas pouco estudadas negligenciadas 1,2. Os fatores que contribuem para esse efeito incluem a importância biológica e a relevância da doença de certas proteínas. Além disso, pesquisas prévias que oferecem conhecimento fundamental, bem como a disponibilidade de ferramentas para análise funcional, estimulam ainda mais a pesquisa sobre

Protocol

1. Configuração experimental

  1. Use um termociclador que possa detectar fluorescência, como um instrumento RT-PCR, para executar o protocolo descrito. Se estiver usando o SYPRO Orange, conforme descrito neste protocolo, use um modo de varredura que permita excitação em torno de 470 nm e detecção de emissão em torno de 570 nm. Programe o termociclador para manter a amostra a 20 °C por 2 min, seguido de um aumento de temperatura de 0,5 °C/1 min até 95 °C.......

Representative Results

O SelO eucariótico consiste em uma sequência de direcionamento mitocondrial N-terminal, um domínio semelhante à quinase e uma selenocisteína altamente conservada no terminal C da proteína23. Esta enzima residente mitocondrial codifica um domínio pseudoquinase que é conservado de bactérias para humanos23. A análise estrutural do homólogo SelO de Pseudomonas syringae revelou alterações de aminoácidos no sítio ativo que.......

Discussion

O Thermal Shift Assay (TSA) serve como um método eficiente para rastrear interações proteína-ligante, incluindo aquelas com cofatores e inibidores. Neste protocolo, usamos TSA para medir a ligação da pseudoquinase SelO a nucleotídeos e cátions divalentes. Nossos achados mostram que o SelO exibe maior estabilidade térmica na presença de ATP e Mg2+/Mn2+. Esta observação se alinha com relatórios anteriores indicando que homólogos SelO de E. coli, S. c.......

Acknowledgements

A.S. é bolsista W.W. Caruth, Jr. em Pesquisa Biomédica, bolsista do Instituto de Pesquisa e Prevenção do Câncer do Texas (CPRIT) e bolsista do corpo docente do Centro Charles e Jane Pak de Metabolismo Mineral e Pesquisa Clínica. Este trabalho foi apoiado pelo NIH Grant K01DK123194 (AS), CPRIT Grant RR190106 (AS), Welch (I-2046-20200401) e Welch (I-2046-20230405).

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigma AldrichA2383-10Gused for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assemblyBeckman CoulterC19416
CFX Opus 384 Real-time PCR systemBio-Rad12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/whiteBio-RadHSP3805
Magnesium ChlorideSigma AldrichM8266-100Gused for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrateSigma AldrichM3634-500Gused for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, opticalBio-RadMSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stainSigma AldrichS5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrateSigma AldrichU6625-100MGused for representative results but not required to perfom TSA

References

  1. Dunham, I. Human genes: Time to follow the roads less traveled. PLoS Biol. 16 (9), e3000034 (2018).
  2. Kustatscher, G., et al. An open invitation to the understudied proteins initiative. Nat Biotechnol.

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