用于神经突生长测量的新型半自动软件的标准化

Summary

神经突生长测定提供了有关再生神经元过程的定量值。这种半自动软件的优点是它通过创建掩码分别分割细胞体和神经突，并测量各种参数，例如神经突长度、分支点数量、细胞体簇面积和细胞簇数量。

Abstract

有效的实时成像技术对于评估神经元形态以实时测量神经突生长至关重要。多年来，正确测量神经突生长物一直是神经科学研究领域的一个长期挑战。该参数是许多 体外 实验设置的基础，范围从解离培养物和器官型培养物到细胞系。通过量化神经突长度，可以确定特定治疗是否有效，或者不同实验组中的轴突再生是否增强。本研究旨在证明 Incucyte® Neurotrack 神经突生长分析软件的稳健性和准确性。这种半自动软件可用于延时显微镜系统，与常用方法相比，它在量化相差图像中的神经突长度方面具有多项优势。该算法对每张图像中的多个参数进行屏蔽和量化，并返回神经元细胞指标，包括神经突长度、分支点、细胞-体簇和细胞-体簇区域。首先，我们通过将软件的值与斐济插件手动 NeuronJ 的值相关联，验证了该软件的稳健性和准确性。其次，我们使用的算法能够同时处理相差图像和免疫细胞化学图像。使用特异性神经元标志物，我们验证了在 体外 培养中感觉神经元上基于荧光的神经突生长分析的可行性。此外，该软件可以测量各种接种条件下的神经突长度，从单个细胞到复杂的神经元网。总之，该软件为神经突生长测定提供了一个创新且高效的平台，为更快、更可靠的定量铺平了道路。

Introduction

在坐骨神经中，可以测量轴突再生¹ （axonal regenerations）。此外，体外研究表明，在健康和受伤神经元中监测轴突生长 ^2,3 以理解其各个阶段（从轴突发芽到轴突变性）的可行性。通过跟踪这些过程，可以测量轴突极性、起始、稳定性和分支等参数。最后一个参数对于理解神经性疼痛感知至关重要 ^4,5,6。同样，轴突变性可以在体内⁷ 或体外监测 ^8,9。在神经突生长过程中，肌动蛋白和微管细胞骨架网络稳定或根据细胞的需要发生变化¹⁰。肌动蛋白细胞骨架重组以允许形成轴突生长锥，微管重新排列成束以稳定生长的神经突¹¹。为了在体外研究中枢和外周神经元的神经突生长，量化了三个常见....

Protocol

1. 扫描机器上的容器

注意：检测由内置的 Basler Ace 1920-155 μm 相机执行。

1. 单击 Connect to Device 并选择 Schedule - To Acquire，打开程序。然后点击 + 号。
2. 通过分别选择选项 Scan on Schedule （按计划扫描 ） 或 Scan Once Now （立即扫描一次） 来指定船舶是重复扫描还是仅扫.......

Discussion

准确测量神经元在健康、受伤和患病条件下的生长情况是神经科学领域内许多实验装置的关键参数。无论是使用整个 DRG 外植体的器官型培养物还是解离培养物，正确测量轴突生长在过去 20 年中都是一项重大挑战。如果没有可靠和准确的神经突生长定量，就无法评估特定治疗是否有效，例如针对 NSC-34 细胞³⁴ 的视黄酸（4 天）或胚胎 DRG 神经元的神经营养.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase A	Merck / Roche	10103586001
Dispase II (neutral protease, grade II)	Merck / Roche	4942078001
Dulbecco's modified eagle's medium	Merck / Sigma	D5796
Fetal bovin serum	Merck / Sigma	F7524
Ham's F-12 Nutrient Mix (1X)	ThermoFisher Scientific	21765029
Ham's F12 w/ L-Glutamine	Euroclone	ECM0135L
Hanks' Balanced Salt Solution	Euroclone	ECM0507L
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	14185045
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (U.S.)	Cytiva	SH30071.03
Incucyte, Neurotrack Analysis Software	Sartorius	9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz)	Millipore/Sigma	L5520
Laminin Mouse Protein, Natural	ThermoFisher Scientific	23017015
L-Cysteine	Merck / Sigma	C7352
Leibovitz's L-15 medium w/o L-glutamine	Euroclone	ECB0020L
mouse NGF 2.5S (>95%)	Alomone Labs	N-100
Neurobasal Medium [-] Glutamine	ThermoFisher Scientific	21103049
NSC-34	CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada)	CLU140
Papain from papaya latex	Sigma	P4762
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15070063
Percoll (Density 1.130 g/mL)	Cytiva	17089101
Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL)	EMD Millipore/Merck	A-003-E
Poly-L-Lysine Solution (0-01%)	Sigma	P4832
Recombinant Human NT-3	PeproTech	450-03
Retinoic Acid	Merck / Sigma	R2625
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
β-Tubulin III (Tuj1) antibody	Merck / Sigma	T8660