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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

神经突生长测定提供了有关再生神经元过程的定量值。这种半自动软件的优点是它通过创建掩码分别分割细胞体和神经突,并测量各种参数,例如神经突长度、分支点数量、细胞体簇面积和细胞簇数量。

Abstract

有效的实时成像技术对于评估神经元形态以实时测量神经突生长至关重要。多年来,正确测量神经突生长物一直是神经科学研究领域的一个长期挑战。该参数是许多 体外 实验设置的基础,范围从解离培养物和器官型培养物到细胞系。通过量化神经突长度,可以确定特定治疗是否有效,或者不同实验组中的轴突再生是否增强。本研究旨在证明 Incucyte® Neurotrack 神经突生长分析软件的稳健性和准确性。这种半自动软件可用于延时显微镜系统,与常用方法相比,它在量化相差图像中的神经突长度方面具有多项优势。该算法对每张图像中的多个参数进行屏蔽和量化,并返回神经元细胞指标,包括神经突长度、分支点、细胞-体簇和细胞-体簇区域。首先,我们通过将软件的值与斐济插件手动 NeuronJ 的值相关联,验证了该软件的稳健性和准确性。其次,我们使用的算法能够同时处理相差图像和免疫细胞化学图像。使用特异性神经元标志物,我们验证了在 体外 培养中感觉神经元上基于荧光的神经突生长分析的可行性。此外,该软件可以测量各种接种条件下的神经突长度,从单个细胞到复杂的神经元网。总之,该软件为神经突生长测定提供了一个创新且高效的平台,为更快、更可靠的定量铺平了道路。

Introduction

在坐骨神经中,可以测量轴突再生1 (axonal regenerations)。此外,体外研究表明,在健康和受伤神经元中监测轴突生长 2,3 以理解其各个阶段(从轴突发芽到轴突变性)的可行性。通过跟踪这些过程,可以测量轴突极性、起始、稳定性和分支等参数。最后一个参数对于理解神经性疼痛感知至关重要 4,5,6。同样,轴突变性可以在体内7 体外监测 8,9在神经突生长过程中,肌动蛋白和微管细胞骨架网络稳定或根据细胞的需要发生变化10。肌动蛋白细胞骨架重组以允许形成轴突生长锥,微管重新排列成束以稳定生长的神经突11。为了在体外研究中枢和外周神经元的神经突生长,量化了三个常见....

Protocol

1. 扫描机器上的容器

注意:检测由内置的 Basler Ace 1920-155 μm 相机执行。

  1. 单击 Connect to Device 并选择 Schedule - To Acquire,打开程序。然后点击 + 号。
  2. 通过分别选择选项 Scan on Schedule (按计划扫描 ) 或 Scan Once Now (立即扫描一次) 来指定船舶是重复扫描还是仅扫.......

Representative Results

神经突生长测量算法能够稳健地检测神经网络和单个神经元中的神经突。它生成一个黄色遮罩,用于分割具有高对比度的对象,例如细胞体、细胞碎片、死细胞、组织外植体和阴影。此外,洋红色面具出现在不同厚度的神经突上。神经突长度值以 mm/mm2 为单位提供,表示轴突长度已除以图像面积,即 0.282739 mm2 并且对于每个扫描条件都是恒定的。因此,为?.......

Discussion

准确测量神经元在健康、受伤和患病条件下的生长情况是神经科学领域内许多实验装置的关键参数。无论是使用整个 DRG 外植体的器官型培养物还是解离培养物,正确测量轴突生长在过去 20 年中都是一项重大挑战。如果没有可靠和准确的神经突生长定量,就无法评估特定治疗是否有效,例如针对 NSC-34 细胞34 的视黄酸(4 天)或胚胎 DRG 神经元的神经营养.......

Acknowledgements

我们要感谢 Alessandro Vercelli 的批评意见和 Sartorius 的技术支持。我们对这些主题的研究得到了 2021 年 Rita-Levi Montalcini Grant(意大利 MIUR)的慷慨支持。这项研究由 Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca MIUR 项目 Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027 资助给神经科学系 Rita Levi Montalcini。D.M.R. 的研究是在意大利国家可持续发展和气候变化大学间博士课程(链接:www.phd-sdc.it)期间并得到其支持。

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Collagenase AMerck / Roche10103586001
Dispase II (neutral protease, grade II)Merck / Roche4942078001
Dulbecco's modified eagle's mediumMerck / SigmaD5796
Fetal bovin serum Merck / SigmaF7524
Ham's F-12 Nutrient Mix (1X)ThermoFisher Scientific21765029
Ham's F12 w/ L-GlutamineEurocloneECM0135L
Hanks' Balanced Salt SolutionEurocloneECM0507L
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol redThermoFisher Scientific14185045
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (U.S.)CytivaSH30071.03
Incucyte, Neurotrack Analysis Software Sartorius9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz)Millipore/SigmaL5520
Laminin Mouse Protein, NaturalThermoFisher Scientific23017015
L-CysteineMerck / SigmaC7352
Leibovitz's L-15 medium w/o L-glutamineEurocloneECB0020L
mouse NGF 2.5S (>95%)Alomone LabsN-100
Neurobasal Medium [-] GlutamineThermoFisher Scientific21103049
NSC-34CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada)CLU140
Papain from papaya latexSigmaP4762
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15070063
Percoll (Density 1.130 g/mL)Cytiva17089101
Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL)EMD Millipore/MerckA-003-E
Poly-L-Lysine Solution (0-01%)SigmaP4832
Recombinant Human NT-3PeproTech450-03
Retinoic AcidMerck / SigmaR2625
Trypsin-EDTA solutionSigmaT3924
β-Tubulin III (Tuj1) antibodyMerck / SigmaT8660

References

  1. Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359, 1416-1421 (2018).
  2. Marvaldi, L., et al. Enhanced axon outgrowth and improv....

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