Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Анализы роста нейритов дают количественную оценку регенеративных нейронных процессов. Преимущество этого полуавтоматического программного обеспечения заключается в том, что оно сегментирует тела клеток и нейриты отдельно, создавая маску, и измеряет различные параметры, такие как длина нейритов, количество точек ветвления, площадь кластера «клетка-тело» и количество кластеров клеток.

Abstract

Эффективные методы визуализации в реальном времени имеют решающее значение для оценки морфологии нейронов с целью измерения роста нейритов в режиме реального времени. Правильное измерение роста нейритов было давней проблемой в области исследований в области нейробиологии на протяжении многих лет. Этот параметр служит краеугольным камнем в многочисленных экспериментальных установках in vitro , начиная от диссоциированных культур и органотипических культур и заканчивая клеточными линиями. Количественно оценивая длину нейрита, можно определить, сработало ли конкретное лечение или усилилась регенерация аксонов в различных экспериментальных группах. Цель данного исследования состоит в том, чтобы продемонстрировать надежность и точность программного обеспечения для анализа разрастания нейритов Incucyte Neurotrack. Это полуавтоматическое программное обеспечение доступно в системе покадровой микроскопии, которая имеет ряд преимуществ по сравнению с широко используемыми методологиями при количественной оценке длины нейритов в фазово-контрастных изображениях. Алгоритм маскирует и количественно оценивает несколько параметров на каждом изображении и возвращает метрики нейронных клеток, включая длину нейритов, точки ветвления, кластеры клетка-тело и площади кластера клеток-тел. Во-первых, мы проверили надежность и точность программного обеспечения, сопоставив его значения с данными ручного плагина NeuronJ из Фиджи. Во-вторых, мы использовали алгоритм, который способен работать как на фазово-контрастных изображениях, так и на иммуноцитохимических изображениях. Используя специфические нейрональные маркеры, мы подтвердили возможность проведения анализа роста нейритов на сенсорных нейронах in vitro на основе флуоресценции. Кроме того, это программное обеспечение может измерять длину нейритов при различных условиях затравки, начиная от отдельных клеток и заканчивая сложными нейронными сетями. В заключение следует отметить, что программное обеспечение предоставляет инновационную и экономичную по времени платформу для анализа роста нейритов, прокладывая путь к более быстрому и надежному количественному определению.

Introduction

В седалищных нервах можно измерить регенерацию аксонов1. Кроме того, исследования in vitro показали возможность мониторинга вырастания аксонов 2,3 для понимания его различных фаз, от прорастания аксонов до аксональной дегенерации, как в здоровых, так и в поврежденных нейронах. Отслеживая эти процессы, можно измерить такие параметры, как аксональная полярность, инициация, стабильность и ветвление. Последний параметр имеет решающее значение для понимания нейропатического восприятия боли 4,5,6

Protocol

1. Сканирование сосуда на машине

ПРИМЕЧАНИЕ: Детектирование осуществляется с помощью встроенной камеры Basler Ace 1920-155 мкм.

  1. Откройте программу, нажав «Подключиться к устройству » и выбрав «Расписание» - «Для приобретения». З.......

Representative Results

Алгоритм измерения нароста нейритов способен обнаруживать нейриты как в нейронных сетях, так и в отдельных нейронах. Он создает желтую маску, которая сегментирует объекты с высокой контрастностью, такие как тела клеток, клеточный мусор, мертвые клетки, эксплантации т.......

Discussion

Точное измерение того, как растут нейроны в здоровых, травмированных и больных условиях, является критическим параметром во многих экспериментальных установках в области нейробиологии. Будь то работа с органотипическими культурами целых эксплантов DRG или диссоциир?.......

Disclosures

Авторы заявляют, что исследование проводилось без каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые потенциально могли бы создать конфликт интересов.

Acknowledgements

Мы хотим поблагодарить Алессандро Верчелли за критические комментарии и техническую поддержку Sartorius за помощь. Наши исследования по этим темам были щедро поддержаны грантом Риты-Леви Монтальчини 2021 года (MIUR, Италия). Это исследование было профинансировано Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027 для Департамента неврологии Риты Леви Монтальчини. Исследования D.M.R. проводились во время и при поддержке итальянского национального межуниверситетского курса PhD в области устойчивого развития и изменения климата (ссылка: www.phd-sdc.it).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Collagenase AMerck / Roche10103586001
Dispase II (neutral protease, grade II)Merck / Roche4942078001
Dulbecco's modified eagle's mediumMerck / SigmaD5796
Fetal bovin serum Merck / SigmaF7524
Ham's F-12 Nutrient Mix (1X)ThermoFisher Scientific21765029
Ham's F12 w/ L-GlutamineEurocloneECM0135L
Hanks' Balanced Salt SolutionEurocloneECM0507L
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol redThermoFisher Scientific14185045
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (U.S.)CytivaSH30071.03
Incucyte, Neurotrack Analysis Software Sartorius9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz)Millipore/SigmaL5520
Laminin Mouse Protein, NaturalThermoFisher Scientific23017015
L-CysteineMerck / SigmaC7352
Leibovitz's L-15 medium w/o L-glutamineEurocloneECB0020L
mouse NGF 2.5S (>95%)Alomone LabsN-100
Neurobasal Medium [-] GlutamineThermoFisher Scientific21103049
NSC-34CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada)CLU140
Papain from papaya latexSigmaP4762
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15070063
Percoll (Density 1.130 g/mL)Cytiva17089101
Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL)EMD Millipore/MerckA-003-E
Poly-L-Lysine Solution (0-01%)SigmaP4832
Recombinant Human NT-3PeproTech450-03
Retinoic AcidMerck / SigmaR2625
Trypsin-EDTA solutionSigmaT3924
β-Tubulin III (Tuj1) antibodyMerck / SigmaT8660

References

  1. Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359, 1416-1421 (2018).
  2. Marvaldi, L., et al. Enhanced axon outgrowth and improv....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved