A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
Анализы роста нейритов дают количественную оценку регенеративных нейронных процессов. Преимущество этого полуавтоматического программного обеспечения заключается в том, что оно сегментирует тела клеток и нейриты отдельно, создавая маску, и измеряет различные параметры, такие как длина нейритов, количество точек ветвления, площадь кластера «клетка-тело» и количество кластеров клеток.
Эффективные методы визуализации в реальном времени имеют решающее значение для оценки морфологии нейронов с целью измерения роста нейритов в режиме реального времени. Правильное измерение роста нейритов было давней проблемой в области исследований в области нейробиологии на протяжении многих лет. Этот параметр служит краеугольным камнем в многочисленных экспериментальных установках in vitro , начиная от диссоциированных культур и органотипических культур и заканчивая клеточными линиями. Количественно оценивая длину нейрита, можно определить, сработало ли конкретное лечение или усилилась регенерация аксонов в различных экспериментальных группах. Цель данного исследования состоит в том, чтобы продемонстрировать надежность и точность программного обеспечения для анализа разрастания нейритов Incucyte Neurotrack. Это полуавтоматическое программное обеспечение доступно в системе покадровой микроскопии, которая имеет ряд преимуществ по сравнению с широко используемыми методологиями при количественной оценке длины нейритов в фазово-контрастных изображениях. Алгоритм маскирует и количественно оценивает несколько параметров на каждом изображении и возвращает метрики нейронных клеток, включая длину нейритов, точки ветвления, кластеры клетка-тело и площади кластера клеток-тел. Во-первых, мы проверили надежность и точность программного обеспечения, сопоставив его значения с данными ручного плагина NeuronJ из Фиджи. Во-вторых, мы использовали алгоритм, который способен работать как на фазово-контрастных изображениях, так и на иммуноцитохимических изображениях. Используя специфические нейрональные маркеры, мы подтвердили возможность проведения анализа роста нейритов на сенсорных нейронах in vitro на основе флуоресценции. Кроме того, это программное обеспечение может измерять длину нейритов при различных условиях затравки, начиная от отдельных клеток и заканчивая сложными нейронными сетями. В заключение следует отметить, что программное обеспечение предоставляет инновационную и экономичную по времени платформу для анализа роста нейритов, прокладывая путь к более быстрому и надежному количественному определению.
В седалищных нервах можно измерить регенерацию аксонов1. Кроме того, исследования in vitro показали возможность мониторинга вырастания аксонов 2,3 для понимания его различных фаз, от прорастания аксонов до аксональной дегенерации, как в здоровых, так и в поврежденных нейронах. Отслеживая эти процессы, можно измерить такие параметры, как аксональная полярность, инициация, стабильность и ветвление. Последний параметр имеет решающее значение для понимания нейропатического восприятия боли 4,5,6
1. Сканирование сосуда на машине
ПРИМЕЧАНИЕ: Детектирование осуществляется с помощью встроенной камеры Basler Ace 1920-155 мкм.
Алгоритм измерения нароста нейритов способен обнаруживать нейриты как в нейронных сетях, так и в отдельных нейронах. Он создает желтую маску, которая сегментирует объекты с высокой контрастностью, такие как тела клеток, клеточный мусор, мертвые клетки, эксплантации т.......
Точное измерение того, как растут нейроны в здоровых, травмированных и больных условиях, является критическим параметром во многих экспериментальных установках в области нейробиологии. Будь то работа с органотипическими культурами целых эксплантов DRG или диссоциир?.......
Мы хотим поблагодарить Алессандро Верчелли за критические комментарии и техническую поддержку Sartorius за помощь. Наши исследования по этим темам были щедро поддержаны грантом Риты-Леви Монтальчини 2021 года (MIUR, Италия). Это исследование было профинансировано Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027 для Департамента неврологии Риты Леви Монтальчини. Исследования D.M.R. проводились во время и при поддержке итальянского национального межуниверситетского курса PhD в области устойчивого развития и изменения климата (ссылка: www.phd-sdc.it).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Collagenase A | Merck / Roche | 10103586001 | |
Dispase II (neutral protease, grade II) | Merck / Roche | 4942078001 | |
Dulbecco's modified eagle's medium | Merck / Sigma | D5796 | |
Fetal bovin serum | Merck / Sigma | F7524 | |
Ham's F-12 Nutrient Mix (1X) | ThermoFisher Scientific | 21765029 | |
Ham's F12 w/ L-Glutamine | Euroclone | ECM0135L | |
Hanks' Balanced Salt Solution | Euroclone | ECM0507L | |
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 14185045 | |
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (U.S.) | Cytiva | SH30071.03 | |
Incucyte, Neurotrack Analysis Software | Sartorius | 9600-0010 | |
L-15 Medium (Leibovitz) | Millipore/Sigma | L5520 | |
Laminin Mouse Protein, Natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
L-Cysteine | Merck / Sigma | C7352 | |
Leibovitz's L-15 medium w/o L-glutamine | Euroclone | ECB0020L | |
mouse NGF 2.5S (>95%) | Alomone Labs | N-100 | |
Neurobasal Medium [-] Glutamine | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
NSC-34 | CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada) | CLU140 | |
Papain from papaya latex | Sigma | P4762 | |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
Percoll (Density 1.130 g/mL) | Cytiva | 17089101 | |
Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL) | EMD Millipore/Merck | A-003-E | |
Poly-L-Lysine Solution (0-01%) | Sigma | P4832 | |
Recombinant Human NT-3 | PeproTech | 450-03 | |
Retinoic Acid | Merck / Sigma | R2625 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
β-Tubulin III (Tuj1) antibody | Merck / Sigma | T8660 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved