Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול מתואר להכנת מודל פשוט של מערכת אקולוגית המשחזרת את שיפוע מונה המתאן-חמצן שנמצא בבית הגידול הטבעי של חיידקים מחמצני מתאן אירוביים, ומאפשר לחקור את הפיזיולוגיה שלהם בהקשר של פתרון מרחבי. כמו כן מתוארים שינויים בבדיקות ביוכימיות נפוצות לשימוש במערכת האקולוגית של המודל מבוסס האגרוז.

Abstract

חיידקים מחמצני מתאן אירוביים, הידועים בשם מתאנוטרופים, ממלאים תפקידים חשובים במחזור ביו-גיאוכימי. מתאנוטרופים תופסים נישה סביבתית ספציפית בתוך שיפועים נגדיים של מתאן-חמצן הנמצאים בקרקעות ובמשקעים, מה שמשפיע על התנהגותם ברמת הפרט והקהילה. עם זאת, שיטות קונבנציונליות לחקר הפיזיולוגיה של מיקרואורגניזמים מפחיתי גזי חממה אלה משתמשות לעתים קרובות בתרבויות פלנקטוניות הומוגניות, שאינן מייצגות במדויק את השיפועים המרחביים והכימיים הנמצאים בסביבה. זה מעכב את ההבנה של מדענים כיצד חיידקים אלה מתנהגים באתרם. כאן מתוארת מערכת אקולוגית פשוטה וזולה הנקראת מזרק הדרגתי, המשתמשת באגרוז מוצק למחצה כדי לשחזר את שיפועי הנגד התלולים של מתאן-חמצן האופייניים לבתי הגידול הטבעיים של המתאנוטרופים. מזרק השיפוע מאפשר גידול זנים מתאנוטרופיים והעשרה של קונסורציום מחמצן מתאן מעורב מדגימות סביבתיות, וחושף פנוטיפים הנראים רק בהקשר מרחבי זה. פרוטוקול זה מדווח גם על בדיקות ביוכימיות שונות ששונו כך שיתאימו למטריצת האגרוז המוצקה למחצה, אשר עשויה להיות בעלת ערך לחוקרים המגדלים מיקרואורגניזמים במערכות מבוססות אגרוז אחרות.

Introduction

מיקרואורגניזמים החיים בממשק אנוקסי-אוקסי ממלאים לעתים קרובות תפקידים אקולוגיים חשובים1. דוגמה אחת היא חיידקים מחמצני מתאן אירוביים (מתאנוטרופים), הקיימים בשיפועים נגדיים של מתאן וחמצן בקרקעות ובמשקעים2. מיקרואורגניזמים אלה הם בעלי מאפיינים מטבוליים ופיזיולוגיים ייחודיים המאפשרים להם לנצל את שיפועי הגזים הקיימים בסביבתם והיו נושא למחקר מתמשך במשך עשרות שנים 3,4,5. כיום, רוב המחקרים המתפרסמים על מתאנוטרופים וקהילות מחמצני מתאן מבוססים על עבודה עם תרביות פלנקטוניות הומוגניות שלעתים קרובות אינן מצליחות ללכוד את השיפועים המרחביים והכימיים הטבועים בבתי הגידול המיקרוביאליים הטבעיים שלהן. מגבלה זו מעכבת את הבנתנו את הפיזיולוגיה המיקרוביאלית ואת יכולתנו לקשר מידע גנומי לתכונות פנוטיפיות.

פרוטוקול זה מדווח על מודל פשוט ומבוסס מעבדה שיוצר תנאים הניתנים לשחזור לחקר מתאנוטרופים ספציפיים, כגון זן Methylomonas sp. LW13, וקהילות מחמצני מתאן ישירות מדגימות קרקע סביבתיות. חשוב לציין, גידול במזרק ההדרגתי גורם לפנוטיפים ספציפיים לשיפוע נגדי שאינם קיימים בתרביות פלנקטוניות הומוגניות6, מה שמדגיש את יכולתה של המערכת לחשוף היבטים חדשים של הפיזיולוגיה של המתאנוטרופ. בהשראת מודלים של מערכות אקולוגיות 7,8,9 שפורסמו בעבר, מזרק השיפוע הוא שיטה פשוטה שניתן להשתמש בה כדי לאסוף מידע כימי ומולקולרי ממיקרואורגניזמים שגודלו בתרבית באמצעות גישה זו.

הנהלים המדווחים לניתוחים גנטיים, כימיים ומולקולריים שונו כדי לעבוד באופן אמין על תרביות מיקרוביאליות שגדלו בתוך מטריצת אגרוז מוצקה למחצה. הליכים אלה עשויים להיות שימושיים גם לניתוח חיידקים הגדלים במערכות מוצקות למחצה אחרות המבוססות על אגרוז, כגון אלה המשמשות למבחני שחייה של אגר רך חיידקי. התאמת הניתוחים האלה להקשרים שנפתרו במרחב עשויה לפתוח דרכים חדשות לחקר חיים מיקרוביאליים בסביבות רלוונטיות יותר מבחינה אקולוגית.

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה ושחול של מזרקים הדרגתיים

הערה: הכנת מזרק הדרגתי צריכה להתבצע בטכניקה סטרילית.

  1. השתמש במספר מושבות של Methylomonas sp. LW13 שגדל טרי על צלחת כדי לחסן 6 מ"ל של מלחים מינרליים חנקתיים (NMS) בינוני בצינור זכוכית בגודל 18 מ"מ x 150 מ"מ. אטמו את הצינור עם פקק בסרום ואטם אלומיניום, והוסיפו מתאן באמצעות מזרק לאטמוספירה סופית של 50% (v/v) מתאן באוויר. נערו את התרבית הנוזלית הפלנקטונית הזו ב-200 סל"ד בטמפרטורת החדר עד לעכירות (בערך יום אחד).
  2. מעבר תרביות נוזליות 1:10 למדיה רעננה. המשך גידול תרביות נוזליות של מתאנוטרופים לגידול שלב לוג (OD600 של ~0.5) והתאם ל- OD600 =1.0.
  3. הכינו מזרקים על ידי הסרת הבוכנה הנלווית ושמירתם במיכל סטרילי. חברו קצה מסנן PTFE סטרילי למזרק והניחו אותו במדף מבחנה סטנדרטי כשהקצה פונה כלפי מטה.
  4. עבור כל מזרק 10 מ"ל, יש לערבב היטב 1 מ"ל תאים משלב 1.2 עם 5 מ"ל NMS ו-4 מ"ל אגרוז מותך (0.5% m/v, מקורר ל-55°C) בצינור חרוטי סטרילי. ניתן להגדיל נפחים אלה כדי למלא מזרקים מרובים במקביל.
  5. לאט לשפוך או להשתמש פיפט סרולוגי להוסיף את התערובת לכל מזרק, עד סימון 8 מ"ל. אפשר לאגרוז בתוך מזרקים להתמצק (~ 15 דקות), ואז מכסים עם פקק בוטיל גומי סטרילי בקוטר 20 מ"מ. הדקו את הפקק למזרק באמצעות סרט מעבדה ותייגו אותו בתכולת מזרק.
  6. כדי להוסיף מתאן למרווח הראש של המזרק, מלא מזרק גדול (60 מ"ל) עם 100% CH4 וחבר קצה מסנן PTFE (0.2 מיקרומטר, 25 מ"מ) המחובר למחט סטרילית (23 גרם). ניקבו את פקק הגומי עם המזרק הגדול ונקבו מחט סטרילית שנייה דרך הפקק ליצירת יציאת גז.
  7. לחץ על הבוכנה על המזרק הגדול כדי לאפשר 20 מ"ל של 100% CH4 לשטוף דרך חלל הראש, דואג להסיר את מחט היציאה כאשר נשאר 1-2 מ"ל של CH4 במזרק הגדול כדי למנוע זרימת חמצן דרך מחט היציאה.
  8. לדגור על מזרקים ב 18 ° C, לחזור על שלבים 1.6 ו 1.7 מדי יום כדי לחדש את המתאן.
  9. כדי להבליט אגרוז, החלף את קצה מסנן PTFE במחט סטרילית של 23 גרם והחלף את פקק הגומי בבוכנת המזרק שסופקה. לחץ באיטיות על הבוכנה כדי לחלק מרווחים של 1 מ"ל לצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים נפרדים של 1.5 מ"ל.

2. קביעת ריכוזי גזי שיפוע נגדיים

  1. מדידת שיפוע החמצן המומס
    1. השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך לרוחב מזרק מלא אגארוז (שהוכן לפי שלבים 1.1-1.8) קרוב למסנן PTFE. הדקו את המזרק הפתוח למשאבת מזרק המכוונת למיקרואלקטרודה מסוג קלארק, כאשר הקצה הפתוח פונה לקצה האלקטרודה.
    2. התאם את ההגדרות של משאבת המזרק כדי להזיז את המזרק לכיוון המיקרואלקטרודה בקצב של 1 מ"ל/דקה (0.6 ס"מ לדקה); התחל להקליט את מדידות החמצן המומס בתוכנת Unisense Logger ברגע שמשאבת המזרק מתחילה לנוע.
  2. מדידת שיפוע המתאן
    1. מיד לפני השחול, החלף את קצה מסנן המזרק בסטפקוק חד כיווני המחובר למחט 23 גרם, והחלף במהירות את פקק הגומי בבוכנה מזרק. הוסף שמונה עלי אגרוז 1 מ"ל לבקבוקונים אטומים לגז שפונו 12 מ"ל ואפשר לדגימות להתאזן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
    2. אזנו את בקבוקוני הדגימה ללחץ אטמוספרי על ידי פיצוח פתיחה ואטימה מחדש מיידית של בקבוקונים או פירסינג והסרה מהירה של מחט. הזריקו 500 מיקרוליטר של מרווח ראש בקבוקון לכרומטוגרף גז עם זיהוי יינון להבה (GC-FID) באמצעות מזרק אטום לגז. צור עקומת כיול הנגזרת מתקני CH4 כדי להמיר שטח שיא (pA*min) ל- μmol/L.

3. ספירת תאים במזרק ההדרגתי

  1. ציטומטריית זרימה
    1. להוציא 1 מ"ל של מקטעי אגרוז ממזרקים הדרגתיים שחוסנו ב-LW13 פראי או מוטנטי כמתואר בשלב 1.9. כמו כן, הכינו והוציאו אגרוז ממזרק סטרילי ללא תאים כבקרה שלילית.
    2. הוסף 0.75 מ"ל של 0.85% (m/v) NaCl במים לכל דגימות האגרוז המורחבות והומוגניזציה על ידי מערבולות. יתר על כן, לדלל דגימות 1:10 על ידי העברת 100 μL לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש והוספת 900 μL של תמיסת מלח.
    3. הוסיפו 3 μL של תערובת 1:1 של כתמי SYTO9 ופרופידיום יודיד, ולאחר מכן דגרו בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. כדי לקבוע את התאים לכל מ"ל של agarose, sonicate מיקרוספירה ספירת חרוזים השעיה באמבט מים במשך 5 דקות. לאחר מכן, הוסף 10 μL של התרחיף לכל דגימה לפני ניתוח ציטומטריית זרימה.
    4. נתח דגימות עם ציטומטר זרימה10,11 עם הפרמטרים הבאים: הפעלת פלואורסצנטיות ירוקה, קצב זרימה של 10 μL/s וקצב ניתוח חלקיקים מתחת ל-1,000 חלקיקים לשנייה.
      1. השוואה בין SSC ל- נקודות FITC מתחלקות בין דגימות בקרה נטולות תאים לבין דגימות אגרוז מחוסנות כדי לצייר שערי מתח "אירוע חיידקי" שאינם כוללים חלקיקי אגרוז ברקע. בנוסף, ציירו שערי מתח עבור חרוזי ספירת המיקרספירה, אשר צריכים להיות עקביים בין הדגימות.
    5. כדי לקבוע את ריכוז התאים בכל מקטע אגרוז בתוך מזרק השיפוע, השתמש במשוואה הבאה, וציין כי גורם הדילול עבור הפרוטוקול לעיל הוא 17.7275 וכי 10-6 מ"ל הוא נפח של חרוז מיקרוספירה אחד.
      figure-protocol-4787
  2. ספירת יחידות יוצרות מושבה בתוך מזרק השיפוע
    1. שלטו 1 מ"ל של מקטעי אגרוז לצינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים וסטריליים של 2 מ"ל, הוסיפו 800 מיקרוליטר של NMS, ומערבולות במשך 10 שניות כדי לסייע בפיפט.
    2. הכינו צלחת סטרילית של 96 בארות על ידי הוספת 180 מיקרוליטר NMS לכל באר. מוסיפים 20 μL של דגימות אגרוז מדוללות לכל באר בטור הראשון ופיפט לערבוב.
    3. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, מדללים דגימות סדרתיות פי עשרה על ידי העברת 20 μL מהשורה הראשונה של הבארות לשורה השנייה של הבארות וצנרת 10 פעמים כדי לערבב. המשך בתהליך זה עד לשורה האחרונה של הצלחת.
    4. תייג לוחות רשת מרובעים המכילים NMS, אגר או מדיה לפי בחירה. בעזרת פיפטה רב ערוצית, מאתרים 5 μL מעמוד של צלחת 96 בארות על צלחת האגר. בהתאם לגודל צלחת האגר, ניתן להבחין במספר עמודות על אותה צלחת.
    5. לדגור על לוחות מתחת ל-40% מתאן באוויר ולגדול ב-18°C. ספרו מושבות חיידקים לאחר 2-3 ימים וקבעו את היחידות יוצרות המושבה למיליליטר (CFU/mL).

4. בדיקות זיהוי ביומולקולות

  1. בדיקת פוליסכריד
    1. הוציאו 1 מ"ל של מקטעי אגרוז לצינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים של 2 מ"ל וערבבו עם 1 מ"ל של תמיסת 1% (m/v) Na2CO3 במים. מחממים דגימות ל-80°C למשך 30 דקות עם מערבולות כל 5-10 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-4,000 x גרם ב-4°C למשך 20 דקות.
    2. לאסוף את supernatant בשילוב עם שלושה נפחים של 100% אתנול ולדגור ב 20 ° C לפחות 2 שעות (או לילה).
    3. אספו את הרב-סוכרים המואצים באתנול באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורה של 16,100 x גרם ב-4°C למשך 30 דקות. מוציאים את הסופרנאטנט ומייבשים את הכדורית באוויר. להשעות מחדש את הגלולה ב 100 μL של מים deionized.
    4. מדוד את תכולת הרב-סוכר היחסית של כל מקטע אגרוז באמצעות בדיקה קולורימטרית של חומצה פנול-גופרתית12,13. ערבבו 50 μL של תמצית מרחפים עם 150 μL של חומצה גופרתית מרוכזת ו 30 μL של 5% (v/v) פנול במים בצלחת שקופה של 96 בארות.
    5. מדוד את הספיגה ב- 490 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחות וחשב את תכולת הרב-סוכר היחסית של כל מקטע אגרוז כאחוז מהספיגה של מקטע האגרוז הקרוב ביותר למסנן PTFE.
  2. בדיקת חלבון
    1. הוציאו את האגרוז לצינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים של 1.5 מ"ל והעבירו 100 מיקרוליטר מכל אליקוט למבחנות זכוכית.
    2. קבע את ריכוז החלבון הכולל באמצעות פרוטוקול המבחנה של ערכת בדיקת חלבון BCA. הכינו אלבומין תקני BSA עם אגרוז שהושחל ממזרק סטרילי כמדלל.
  3. בדיקת DNA חוץ-תאי
    1. שלטו את האגרוז לצינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים של 1.5 מ"ל והעבירו 20 מיקרו-ליטר מכל אחד לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 0.2 מ"ל.
    2. מדוד ריכוזי DNA באמצעות ערכת הבדיקה 1x dsDNA בעלת רגישות גבוהה הזמינה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.

5. מיצוי RNA

  1. הכן את מאגר המיצוי על ידי שילוב הדברים הבאים ב 800 מ"ל של מים ללא RNase: 2.0 גרם של CTAB, 2.0 גרם של polyvinylpyrrolidone (PVP 40), 81.8 גרם של NaCl, 100 mM של Tris-HCl (pH 8.0), ו 20 mM של EDTA. להעלות את עוצמת הקול ל 1 L ו autoclave; יש לאחסן ב-4°C.
  2. Aliquot את מאגר מיצוי מוכן ולהוסיף 1% (v/v) ריכוז סופי של בטא מרקפטואתנול ממש לפני השימוש. חממו את החיץ ל-65°C באמצעות אמבט מים או בלוק חום.
  3. חלק כל מזרק שיפוע ל -1 מקטעים מ"ל על ידי שחול אגרוז לצינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים ללא RNase 2 מ"ל לאחר ההליך בשלב 1.9.
  4. דגימות צנטריפוגות בטמפרטורה של 21,000 x גרם, 4°C, למשך 15 דקות ומשליכות את הסופרנטנט, תוך שמירה על דגימות על קרח.
  5. הוסף 600 μL של חיץ מיצוי שחומם מראש לכל גלולה 1 מ"ל של אגרוז מושחל. הוסיפו כ-200 מיקרוליטר של חרוזי זירקוניה/סיליקה וצרו הומוגניות במשך 3 דקות במהירות של 30 הרץ/שנייה באמצעות מקציף חרוזים, ועצרו באמצע הדרך כדי להניח דגימות על קרח למשך 2 דקות.
  6. צנטריפוגה את הדגימות ב 15,000 x גרם, 4 ° C, במשך 2 דקות כדי להפחית קצף. לחלץ דגימות על ידי הוספת 600 μL של כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (24: 1) לצינורות מערבולות במשך 10 שניות.
  7. צנטריפוגה הדגימות ב 15,000 x גרם, 4 ° C, במשך 8 דקות. מעבירים בזהירות את הפאזה המימית העליונה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ללא RNase ומוסיפים 600 μL של כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (24:1) לשלב העליון המועבר ולמערבולת למשך 10 שניות.
  8. צנטריפוגות הדגימות ב 15,000 x גרם, 4 ° C, במשך 8 דקות ולהעביר את הפאזה המימית העליונה החדשה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ללא RNase. הוסף נפח שווה של איזופרופנול לשלב העליון המועבר ודגר על דגימות במשך מספר שעות ב -20 ° C. אופציונלי: דגימות ניתן להשאיר ב -20 °C למשך הלילה.
  9. איסוף משקעים המכילים RNA על ידי דגימות צנטריפוגות ב 16,100 x גרם, 4 ° C במשך 30 דקות.
  10. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הגלולה עם 300 מיקרוליטר אתנול קר 75% (v/v) המיוצר עם מים וצנטריפוגות נטולי RNase בטמפרטורה של 16,100 x גרם, 4°C, למשך 5 דקות.
  11. שטפו שוב את הכדוריות לאחר שלב 5.10.
  12. לאחר הסרת הסופרנטנט אתנול, הניחו לכדוריות להתייבש באוויר במשך 15 דקות. ממיסים כדוריות ב-100 מיקרוליטר מים נטולי RNase.
  13. יש לטפל בדגימות עם DNase I בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  14. השבתת DNase I על ידי הוספת 300 μL של פנול חומצה: כלורופורם: IAA (125:24:1, pH 4.5). מערבלים במשך 10 שניות ודגרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
  15. צנטריפוגה ב 16,100 x גרם, 4 ° C, במשך 5 דקות ולשמור על הפאזה המימית העליונה על ידי העברתו לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ללא RNase.
  16. אופציונלי: מאגר RNA מאותו מקטע על פני כל מזרקי ההעתקה על ידי שילוב השלבים העליונים לתוך צינור חרוט.
  17. הוסף נפח אחד של איזופרופנול השווה לנפח הפאזה העליונה המכילה RNA והוסף 7.5 M של LiCl לריכוז סופי של 0.8 M, היפוך מספר פעמים כדי לערבב.
  18. לדגור את הדגימות במשך מספר שעות ב -20 מעלות צלזיוס. אופציונלי: דגימות ניתן להשאיר ב -20 °C למשך הלילה.
  19. צנטריפוגו את הדגימות במהירות של 16,100 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 15 דקות והשליכו בזהירות את הסופרנטנט. שטפו את הגלולה המכילה RNA פעמיים על ידי הוספת אתנול קר 70% (v/v) במים נטולי RNase, צנטריפוגה ב 16,100 x גרם, 4 °C, במשך 5 דקות, והסרת supernatant.
  20. הניחו לכדוריות להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות והשהו מחדש ב-50 מיקרוליטר מים נטולי RNase. אחסן את דגימות ה- RNA ב -80 ° C.
  21. אופציונלי, בהתאם לאיכות הרנ"א: ניתן לטהר מחדש דגימות באמצעות ערכת טיהור RNA כדי להסיר רנ"א קטן (<200 nt).
  22. כדי לוודא שדגימות RNA אינן מכילות שאריות DNA, השתמש ב- 1 μL של RNA מטוהר כתבנית להגברת PCR באמצעות פריימרים אוניברסליים של גן rRNA 16S חיידקי 27F/1492R. כלול שתי תגובות PCR נוספות המכילות 1 μL של DNA גנומי (1:100 מדולל) או מים נטולי נוקלאז שישמשו כבקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה.
  23. הפעל את המוצרים על ג'ל TBE אגרוז 1% באמצעות אלקטרופורזה ג'ל14.
    הערה: דגימות RNA ללא זיהום DNA אמורות לגרום להיעדר פס בנתיב הדגימה. אם דגימות RNA מראות זיהום DNA, עבד מחדש את הדגימות החל משלב 5.13. RNA מוכן לניתוח במורד הזרם וניתן לנתח אותו באופן אופציונלי כדי לכמת את שלמותו על ידי מדידת מספר שלמות RNA (RIN).

Representative Results

כאן, המערכת האקולוגית של מודל המזרקים ההדרגתיים שימשה לגידול זן יחיד (זן המתאנוטרופ Methylomonas sp. LW13) (איור 1A)6, אולם ניתן להשתמש בו גם כדי להעשיר עבור קהילת חיידקים מחמצני מתאן באמצעות חיסון ישיר של הקרקע (איור 1B). נוכחותו של שיפוע מונה מתאן-חמצן אומתה על-ידי מדידת ריכוז המתאן והחמצן על-פני מזרקים נטולי תאים ומזרקים מחוסנים (איור 1C). עבור מזרקי שיפוע מחוסנים LW13, שיפוע נגדי נוצר תוך יום אחד של שטיפת המזרק, אשר הושרה במשך שלושה ימים של דגירה. במהלך אותה תקופת זמן, נוצר פס אופקי באותו עומק שבו שני מצעי הגז הגיעו לריכוזים הנמוכים ביותר שלהם (איור 1A). שיפוע הגז התלול והדלדול של מתאן וחמצן מעבר לעומק הרצועה האופקית הראו כי LW13 ביצע מטבוליזם אירובי של מתאן ויצר פנוטיפ שלא נצפה בתרבית פלנקטונית הומוגנית. פנוטיפ זה מיוצר גם על ידי חיידקים מתאנוטרופיים אחרים שבודדו מאותה דגימה סביבתית כמו LW136. שונות תלוית זן בתזמון ובעומק של התפתחות הפס האופקי בין זנים מתאנוטרופיים שונים הצביעה על כך שהפס האופקי הושפע מההתנהגות הספציפית של כל מיקרואורגניזם כאשר תורבת בהקשר מרחבי6.

מספר התאים בכל פקק האגרוז נמדד באמצעות ציטומטריית זרימה וספירות מושבות (CFU/mL) (איור 2A). שיטה זו שימשה להשוואת פיזור התאים וההישרדות של LW13 פראי לזן מוטנטי של LW13 המכיל מחיקה בגן fucose 4-O-acetyltransferase (OAT), שהוכח בעבר כמשפיע על התפתחות פס אופקי6. למוטנט ΔOAT של LW13 הייתה צמיחה כללית נמוכה יותר במזרק ההדרגתי במשך 6 ימים בהשוואה לסוג הבר, השפעה שלא נצפתה בתרביות פלנקטוניות הומוגניות מאותם זנים6. הזן המוטנטי לא יצר את אותה רצועה אופקית ברורה כמו הסוג הפראי LW13 כאשר תורבתו במזרק השיפוע (איור 2B). מספרי התאים ומראה הפס האופקי שוחזרו לרמות דומות לסוג הבר עם השלמת גנים בזן המוטנטי. תוצאות אלה מראות כי מזרק השיפוע יכול לשמש לקישור גנים לפנוטיפים ספציפיים הנמצאים רק בשיפוע מונה מתאן-חמצן.

מגוון טכניקות גנטיות, כימיות ומולקולריות הותאמו לשימוש עם חיידקים שגדלו בתוך מטריצת אגרוז מוצקה למחצה. המערכת האקולוגית של מודל מזרק הדרגתי יכולה לשמש בקלות למבחני כימות ביומולקולריים סטנדרטיים עם הכללת אגרוז לא מחוסן כבקרה שלילית. נמדד הריכוז של שלוש ביומולקולות שונות שנמצאות בדרך כלל בחומרים פולימריים חוץ-תאיים ובביופילמים: רב-סוכרים, חלבונים ודנ"א חוץ-תאי15 (איור 3). במקטעי מזרק שחוסנו ב-LW13, הרצועה האופקית הכילה הרבה יותר רב-סוכרים באופן משמעותי מאשר מקטעים אחרים, ללא עלייה משמעותית בחלבון או בדנ"א חוץ-תאי.

RNA-seq שימש למדידת הבדלי שעתוק ב-LW13 הגדלים בעומקים שונים של המזרק. מיצוי RNA חזק הושג באמצעות מאגר מיצוי מבוסס CTAB ואחריו פנול קונבנציונלי: מיצוי כלורופורם ושלבי משקעים. התוצאות מניתוח RNA-seq שימשו מאוחר יותר לזיהוי גנים המעורבים בייצור פס פוליסכריד אופקי. תוצאות אלה מצביעות על כך שהאגרוז המוצק למחצה החיוני ליצירת מערכת אקולוגית של מודל מפוענח מרחבית אינו מונע ניתוחים ביוכימיים נוספים השמורים בדרך כלל לתרבויות פלנקטוניות ומבוססות צלחות.

figure-representative results-3228
איור 1: המערכת האקולוגית של מודל המזרקים ההדרגתיים. (A) מזרק השיפוע שחוסן במתאנוטרופ Methylomonas sp. LW13. רצועה אופקית ברורה (ראש חץ) מתפתחת תוך יומיים מרגע שטיפת המזרק ב-100% מתאן. (B) צילומי תקריב של מזרקים הדרגתיים שחוסנו באדמה מדוללת 10-1 ו-10-4 והודגרו במשך שבועיים. מזרקים הדרגתיים שהכילו אדמה מדוללת יותר יצרו מושבות כדוריות ברחבי האגרוז, בעוד שאינוקולה מרוכזת יותר של הקרקע יצרה רצועה מובחנת. (C) אפיון שיפוע מונה מתאן-חמצן במזרקי שיפוע סטריליים ומחוסני LW13 לאחר שלושה ימי דגירה. הפס האפור מציין את טווח העומקים שבהם הייתה ממוקמת רצועת הרב-סוכר; הנתונים מראים את ממוצע ± SD של שלושה ניסויים עצמאיים עם שלושה עותקים טכניים כל אחד. לוחות (A) ו-(C) שונו מ-Beals et al.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-representative results-4394
איור 2: כימות של סוג הבר LW13 והמוטציה לאחר הדגירה במזרק השיפוע. (A) המספר הכולל של תאי LW13 למ"ל אגרוז מושחל שנמצאו ממזרקים הדרגתיים ביום 0 וביום 7 נמדד על-ידי ציטומטריית זרימה. ΔOAT מכיל מחיקה של הגן fucose 4-O-acetyltransferase, שנמצא כבעל ביטוי גבוה בתאים הממוקמים בעומק הרצועה הרב-סוכרית. ΔOAT+OAT מכיל את הגן OAT המוחדר במיקום דיסטלי של גנום ΔOAT. *, שונה באופן משמעותי ( מבחן t הטרוסדסטי דו-זנבי, α = 0.05); נ.ס., לא שונה משמעותית. הנתונים מראים את ממוצע ± SD של שלושה ניסויים עצמאיים עם שני עותקים טכניים כל אחד. (B) התפתחות רצועה אופקית במזרקים הדרגתיים שחוסנו ב-LW13 wild type, ΔOAT או ΔOAT+OAT לאחר שבעה ימי דגירה. נתון זה שונה מ- Beals et al.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-representative results-5465
איור 3: כימות של ביומולקולות בעומקים הולכים וגדלים של מזרק השיפוע. תכולת רב-סוכר יחסית (%), ריכוז חלבון (מיקרוגרם/מ"ל) וריכוז DNA (ng/μL) בשמונה מקטעים של מזרקי שיפוע מחוסנים LW13 שהודגרו במשך שבעה ימים (עיגולים מלאים; עיגולים פתוחים מראים ערכים ממזרקים הדרגתיים סטריליים). הנתונים מראים את ממוצע ± SD של שלושה ניסויים עצמאיים עם שלושה עותקים טכניים כל אחד. עבור תכולת פוליסכריד יחסית, * מציין הבדל משמעותי מבקרה סטרילית בעומק שווה ערך ( מבחן t הטרוסדסטי דו-זנבי, α = 0.05). עבור ריכוזי חלבונים ודנ"א, * מציין הבדל משמעותי מהקטע המכיל את הפס האופקי (ANOVA חד-כיווני עם ניתוח פוסט-הוק של Tukey-Kramer); נ.ס., לא משמעותי. האיור שונה מ-Beals et al.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

שיטות לגידול מתאנוטרופ
מתאנוטרופים נחקרו במשך עשרות שנים כדי להבין את הפיזיולוגיה שלהם, את ההתנהגות האישית והקהילתית שלהם בסביבה הטבעית, ואת הפוטנציאל שלהם להפחתת מתאן ביישומים תעשייתיים. לאורך מחקרים אלה, חלק גדול מהמחקר שנערך נעשה באמצעות תרבויות פלנקטוניות הומוגניות שבהן ההקשר המרחבי אובד. המערכת האקולוגית של מודל מזרק השיפוע פותחה כדי לשכפל את שיפוע מונה המתאן-חמצן האופייני לבתי גידול טבעיים של מתאנוטרופים במעבדה, ואפשרה לחוקרים לחקור מתאנוטרופים הגדלים בסביבה הדומה יותר למקום שבו אורגניזמים אלה התפתחו.

במהלך 30 השנים האחרונות, חוקרים יצרו מחדש את שיפוע מונה המתאן-חמצן במעבדה באמצעות מגוון שיטות, לעתים קרובות במטרה העיקרית לבודד ולסווג מתאנוטרופים מקונסורציומים מחמצני מתאן מעורבים. ניתן לחלק שיטות אלה לשתי גישות, שתיהן כרוכות בשימוש בתאים מנוגדים של מתאן וחמצן: השעיית קרקע יחסית ללא הפרעה על קרום 16,17,18, או חיסון כמויות קטנות של אדמה או תרבית חיידקים טהורים למדיום מינימלי באגרוז 7,8,19. שיטת המזרק ההדרגתי המתוארת כאן משלבת את הגישה מבוססת המזרקים של דדיש ועמיתיו9 עם טיפוח מתאנוטרופים מעבודות קודמות של אמרל ונואלס8, ושינק ועמיתיו7. האחרונה מבין שיטות אלה הניחה את היסודות לטיפוח מתאנוטרופים בשיפוע מונה מתאן-חמצן והשתמשה בזרימה רציפה של מתאן וחמצן משני צדי תקע האגרוז. בעוד שגישה זו מספקת סביבה קבועה יותר, גישה זו מוסיפה מורכבות למערך הניסוי ומחייבת מקורות גז ייעודיים.

לעומת זאת, מזרק השיפוע המתואר כאן מסתמך על שטיפה יומית של המזרק כדי לספק מתאן טרי, תהליך שלוקח פחות מדקה לכל מזרק, תוך מתן גישה רציפה לחמצן אטמוספרי דרך קצה מסנן PTFE סטרילי. שיטה פשוטה זו עשויה לאפשר אימוץ רחב יותר של מודל זה של המערכת האקולוגית לחקר מתאנוטרופים בהקשר של פתרון מרחבי. הפרוטוקול המתואר מפרט גם ניתוחים כימיים ומולקולריים שניתן לבצע ישירות על חיידקים המודגרים באגרוז המוצק למחצה. כתוצאה מכך, אין צורך לכרות חיידקים ולגדל אותם בתרבית מחוץ למטריצת האגרוז לפני הניתוח, תוך שמירה על תנאי שיפוע הגז בזמן הדגימה.

הערות על הפרוטוקול
מכיוון שהחיידקים מתורבתים בתוך מזרק נפחי מפוליפרופילן, החוקרים יכולים להשתמש בבוכנה הנלווית למזרק כדי לפלח באופן מדויק ומשכפל את פקק האגרוז תוך שמירה על השלמות המרחבית של מטריצת האגרוז שעדיין נותרה בחבית המזרק. ללא העיצוב האטום הטבוע במזרק, היה צורך להסיר את פקקי האגרוז מחבית המזרק ולפרוס אותם, מה שיצר חוסר ודאות בנפח מקטעי האגרוז, ושחרר כמויות בלתי ניתנות לכימות של מתאן וחמצן מומס לאטמוספירה. שחול אגרוז דרך מחט סטרילית מפשט את הכנת הדגימה ומסייע הומוגניזציה של מקטעים מושחלים מבלי לגזור תאי חיידקים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחלק כל מזרק שיפוע מחוסן לשמונה מקטעים לפחות של אגרוז ולבצע ניסויים מקבילים על מתאנוטרופים הגדלים בטווח של ריכוזי חמצן ומתאן.

באופטימיזציה של מיצוי RNA מתכולת רב-סוכר גבוהה, נמצא כי ריאגנטים נפוצים כמו גואנידיום תיוציאנט וטריזול הובילו לג'לציה של אגרוז, שחסמה את עמודי הטיהור והתנגדה לכדוריות באמצעות צנטריפוגה. תפוקות RNA נמוכות ואיכות היו גם מקור לדאגה, שכן מולקולות רב-סוכריות גדולות יכולות ללכוד חומצות גרעין, בעוד שרב-סוכרים קטנים יכולים לזרז יחד עם RNA20. במקום זאת, נעשה שימוש במאגר מיצוי המכיל את CTAB פעילי שטח קטיוניים, אשר מסיס קרומי שומנים20; ו-NaCl, המונע היווצרות קומפלקסים של חומצות גרעין CTAB, ומאפשר לחומצות גרעין לזרז אך שומר על רב-סוכרים בתמיסה21. RNases עברו דנטורציה על ידי הכללת β-מרקפטואתנול במאגר CTAB. עבור ניסוי RNA-seq, שלב טיהור אופציונלי מבוסס עמודות נכלל כדי להוציא RNA קטן (<200 נוקלאוטידים) לפני הכנת הספרייה.

מגבלות ושיקולים
בעוד NMS ואגרוז מספקים מטריצה בינונית מינימלית לטיפוח חיידקים מתאנוטרופיים, מזרק השיפוע כפי שמתואר כאן רק משחזר את שיפועי הגזים של בתי גידול מתאנוטרופיים, אך לא שיפועים אחרים הקיימים בסביבות אלה כגון מתכות קורט22, מליחות23, או חומרי מזון אחרים24. ייתכן שניתן יהיה להוסיף שיפועים אלה למערכת דומה בעתיד. בנוסף, נפח המזרק (8 מ"ל אגרוז) מגביל את סך הביומסה לכל מזרק, מה שמחייב איגום מזרקים מרובים עבור ניתוחים מסוימים (כמתואר בשלב 5.16). למרות שהמזרק הידני מחלק בנוחות את האגרוז לאליציטוטים של 1 מ"ל, גודלו גם מגביל את מרחב הראש לכ -4 מ"ל, ומגביל את כמות המתאן בתפזורת שניתן לאחסן עבור המיקרובים המתורבתים. מאחר שקצב חמצון המתאן פרופורציונלי לקצב הגדילה של מתאנוטרופים אירוביים25, מומלץ לחדש מדי יום את מלאי המתאן במרחב הראש. בעוד שזה עדיין עשוי לגרום לתקופות של הגבלת מתאן, תקופות אלה ניתנות לשחזור במעבדה וככל הנראה מחקות מצבים הנמצאים בסביבות טבעיות.

בעת השימוש במזרק ההדרגתי, נוכחותם של פוליסכרידים agarose מחייב כמה התאמות לבדיקות המשמשות לניתוח מתאנוטרופים שגדלו במערכת זו. לדוגמה, פרוטוקולים הדורשים העברה של כמויות קטנות של אגרוז מושחל דורשים שלבי דילול מרובים עם הומוגניזציה יסודית בין כל דילול לפיפטינג מדויק. בנוסף, במקרים כגון בדיקת פוליסכריד שבהם הרב-סוכרים הטבועים במטריצת האגרוז יגיבו עם מגיב חומצה גופרתית-פנול, הכללת בקרה שלילית סטרילית ונטולת תאים של אגרוז היא חיונית. ניסיונות מוקדמים למתן בעיות אלה על ידי הכללת האנזים אגרוז-הידרוליזה β-אגראז לא צלחו והכניסו משתנה לא ידוע לניסויים הביולוגיים. השימוש במספר שכפולים טכניים, דילול יסודי, הומוגניזציה והכללת פקדים יכולים לשמש כדי להקל על רוב האתגרים הטבועים במטריצת אגרוז.

יישומים
בנוסף למחקרים על זן יחיד, מזרק השיפוע יכול לתמוך בתרבית משותפת של זנים מרובים, ואדמה יכולה לשמש כחיסון במקום תרבית חיידקים טהורה. העיצוב הפשוט של המערכת האקולוגית של מודל מזרק הדרגתי מקובל על תרבית של סוגים אחרים של מיקרואורגניזמים הקיימים בממשק בין סביבות אנוקסיות ואוקסיות באמצעות מצע גז אחר, כגון H2 או CO, במקום מתאן. לסיכום, השימוש במערכת אקולוגית פשוטה של מודל מרחבי מאפשר לחוקרים לחקור את הפיזיולוגיה הייחודית ואת ההתאמות המטבוליות של מיקרואורגניזמים אנוקסיים-אוקסיים, וניתן להשתמש בו כדי לקשר גנים עם פנוטיפים של אורגניזמים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מימון סטארט-אפ מהמחלקה לכימיה באוניברסיטת יוטה ופרס NSF CAREER #2339190. אנו מודים לחברי מעבדת פורי על הדיונים המועילים. אנו מודים לרייצ'ל הארל (אוניברסיטת יוטה) על ההדרכה הראשונית בניסוי ציטומטריית הזרימה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Gas mix analytical standardSupelco225611% each component in nitrogen: carbon monoxide, carbon dioxide, hydrogen, methane and oxygen
100% MethaneAirgasME CP300chemically pure grade
15 ppm Gas mix analytical standardSupelco23470-U15 ppm each component in nitrogen: methane, ethane, ethylene, acetylene, propane, propylene, propyne, and n-butane
1x Nitrate mineral salts see CAS numbers belowDissolve the following in Mili-Q water and autoclave:  0.2 g/L MgSO4·7H2O, 0.2 g/L CaCl2·6H2O, 1 g/L KNO3, and 30 μM LaCl3. Before use, add trace elements to a 1X final concentration and phosphate buffer (pH 6.8) to a final concentration of 5.8 mM.
23 G needleBD Biosciences305194sterile, Luer-Lok
500x Trace elementssee CAS numbers belowDissolve the following in Milli-Q water: 1.0 g/L Na2-EDTA, 2.0 g/L FeSO4·7H2O, 0.8 g/L ZnSO4·7H2O, 0.03 g/L MnCl2·4H2O, 0.03 g/L H3BO3, 0.2 g/L CoCl2·6H2O, 0.6 g/L CuCl2·2H2O, 0.02 g/L NiCl2·6H2O, and 0.05 g/L Na2MoO·2H2O.
96 Well plateCELLTREAT229596sterile
Acid phenol:chloroform:IAA (125:24:1)InvitrogenAM9720 pH 4.5
AgaroseFisher ScientificBP160molecular biology grade, CAS 9012-36-6
Aluminum crimp sealsVWR30618-46020 mm
Bead beaterQiagen9003240TissueLyser III
Butyl rubber stopperChemglass Life Science50-143-85420 mm, blue
Chloroform:isoamyl alcohol (24:1)Millipore Sigma25666BioUltra, for molecular biology
Clark-type O2 microelectrodeUnisenseOX-500
DEPC-treated waterThermo ScientificR0601
DNase I (Ambion)InvitrogenAM2222
Flow cytometerBeckman CoulterCytoFLEX
Gas chromatograph (flame ionization detection)Agilent6890N
Gastight analytical syringeHamilton812201750 TLL
Gastight analytical syringe needleHamilton7729-0722 G, metal hub needle, 2 in, point style 5
Gas-tight vialsLabco938WExetainer vial: 12 mL, round bottom
Glass culture tubesBellco Glass2048-0015018 x 150 mm
LiCl precipitation solution (7.5 M)InvitrogenAM9480
One-way stopcockVWRMFLX30600-00inlet port: female luer, outlet port: male luer lock
Petri dish, squareFisher ScientificFB0875711A100 x 100 mm
Phosphate buffer, 0.2 M (pH 6.8)see CAS numbers belowDissolve the following in Milli-Q water and autoclave: 12.24 g/L KH2PO4, 26.29 g/L Na2HPO4 · 7H2O
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific23225
PTFE syringe filter tipThermo Scientific03-050-469hydrophobic, pore size: 0.2 µm, diameter: 4 mm
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity Assay Kit InvitrogenQ33230
Qubit 4 FluorometerInvitrogenQ33238
RNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchR1013
Serum stopperFisher Scientific03-340-30220 mm
SyringeBD Biosciences302995Luer-Lock, 10 mL, single use, sterile
Syringe pumpNew Era Pump Systems Inc.1000-USNE-1000 one channel programmable
SYTO9, propidium iodide, microspheresInvitrogenL34856LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit
Zirconia/silica beadsBioSpec Products11079101z0.1 mm diameter
Chemical reagentsCAS number
CaCl2·6H2O7774-34-7
CoCl2·6H2O7791-13-1
Concentrated sulfuric acid7664-93-9
CTAB, cetrimonium bromide57-09-0
CuCl2·2H2O10125-13-0
Ethanol64-17-5  
FeSO4·7H2O7782-63-0
H3BO310043-35-3
Isopropanol69-63-0
KH2PO47778-77-0
KNO37757-79-1
LaCl310099-58-8
MgSO4·7H2O10034-99-8
MnCl2·4H2O13446-34-9
Na2CO3, sodium carbonate497-19-8
Na2-EDTA139-33-3
Na2HPO4 · 7H2O7782-85-6
Na2MoO·2H2O10102-40-6
NaCl, sodium chloride7647-14-5
NiCl2·6H2O7791-20-0
Phenol (90% solution in water)108-95-2
PVP40, polyvinylpyrrolidone9003-39-8
Tris-HCl1185-53-1
ZnSO4·7H2O7446-20-0
β-Mercaptoethanol60-24-2

References

  1. Brune, A., Frenzel, P., Cypionka, H. Life at the oxic-anoxic interface: microbial activities and adaptations. FEMS Microbiol Rev. 24 (5), 691-710 (2000).
  2. Auman, A. J., Stolyar, S., Costello, A. M., Lidstrom, M. E. Molecular characterization of methanotrophic isolates from freshwater lake sediment. Appl Environ Microbiol. 66 (12), 5259-5266 (2000).
  3. Whittenbury, R., Phillips, K. C., Wilkinson, J. F. Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria. J Gen Microbiol. 61 (2), 205-218 (1970).
  4. Koo, C., Rosenzweig, A. Biochemistry of aerobic biological methane oxidation. Chem Soc Rev. 50 (5), 3424-3436 (2021).
  5. Strong, P. J., Xie, S., Clarke, W. P. Methane as a resource: Can the methanotrophs add value. Environ Sci Technol. 49 (7), 4001-4018 (2015).
  6. Beals, D. G., Puri, A. W. Linking methanotroph phenotypes to genotypes using a simple spatially resolved model ecosystem. ISME J. 18 (1), wrae060 (2024).
  7. Bussmann, I., Rahalkar, M., Schink, B. Cultivation of methanotrophic bacteria in opposing gradients of methane and oxygen. FEMS Microbiol. Ecol. 56 (3), 331-344 (2006).
  8. Amaral, J. A., Knowles, R. Growth of methanotrophs in methane and oxygen counter gradients. FEMS Microbiol Lett. 126 (3), 215-220 (1995).
  9. Danilova, O. V., et al. A new cell morphotype among methane oxidizers: a spiral-shaped obligately microaerophilic methanotroph from northern low-oxygen environments. ISME J. 10 (11), 2734-2743 (2016).
  10. Ou, F., McGoverin, C., Swift, S., Vanholsbeeck, F. Absolute bacterial cell enumeration using flow cytometry. J Appl Microbiol. 123 (2), 464-477 (2017).
  11. Krause, S. M. B., et al. Lanthanide-dependent cross-feeding of methane-derived carbon is linked by microbial community interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (2), 358-363 (2017).
  12. Masuko, T., et al. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Anal Biochem. 339 (1), 69-72 (2005).
  13. Felz, S., Al-Zuhairy, S., Aarstad, O. A., van Loosdrecht, M. C. M., Lin, Y. M. Extraction of structural extracellular polymeric substances from aerobic granular sludge. J Vis Exp. (115), e54534 (2016).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  15. Costa, O. Y. A., Raaijmakers, J. M., Kuramae, E. E. Microbial extracellular polymeric substances: Ecological function and impact on soil aggregation. Front Microbiol. 9, 1636 (2018).
  16. Sinke, A. J. C., Cottaar, F. H. M., Buis, K., Keizer, P. Methane oxidation by methanotrophs and its effects on the phosphate flux over the sediment-water interface in a eutrophic lake. Microb Ecol. 24 (3), 259-269 (1992).
  17. Murase, J., Frenzel, P. A methane-driven microbial food web in a wetland rice soil. Environ Microbiol. 9 (12), 3025-3034 (2007).
  18. Reim, A., Lüke, C., Krause, S., Pratscher, J., Frenzel, P. One millimetre makes the difference: High-resolution analysis of methane-oxidizing bacteria and their specific activity at the oxic-anoxic interface in a flooded paddy soil. ISME J. 6 (11), 2128-2139 (2012).
  19. Rahalkar, M., Bussmann, I., Schink, B. Methylosoma difficile gen. nov., sp. nov., a novel methanotroph enriched by gradient cultivation from littoral sediment of Lake Constance. Int J Syst Evol Microbiol. 57 (5), 1073-1080 (2007).
  20. Wang, L., Stegemann, J. P. Extraction of high-quality RNA from polysaccharide matrices using cetlytrimethylammonium bromide. Biomaterials. 31 (7), 1612 (2010).
  21. Liyanage, N. M. N., Chandrasekara, B. C. H. W. M., Bandaranayake, P. C. G. A CTAB protocol for obtaining high-quality total RNA from cinnamon (Cinnamomum zeylanicum Blume). 3 Biotech. 11 (4), 201 (2021).
  22. Semrau, J. D., DiSpirito, A. A., Gu, W., Yoon, S. Metals and methanotrophy. Appl Environ Microbiol. 84 (6), e02289-e02317 (2018).
  23. Zhang, S., et al. Salinity significantly affects methane oxidation and methanotrophic community in Inner Mongolia lake sediments. Front Microbiol. 13, 1067017 (2023).
  24. Fox, A. L., Trefry, J. H. Nutrient fluxes from recent deposits of fine-grained, organic-rich sediments in a Florida estuary. Front Mar Sci. , (2023).
  25. He, L., et al. A methanotrophic bacterium to enable methane removal for climate mitigation. Proc Natl Acad Sci. 120 (35), e2310046120 (2023).

Explore More Articles

211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved