胚胎和幼体斑马鱼的高分辨率细胞移植

Summary

在这里，我们提出了一种方案，可以在受精后至少 1 到 7 天之间的任何阶段将具有高空间和时间分辨率的细胞移植到斑马鱼胚胎和幼虫中。

Abstract

发育和再生是通过遗传编码的时空动态细胞相互作用过程发生的。使用动物之间的细胞移植来追踪细胞命运并诱导供体细胞和宿主细胞的遗传、空间或时间特性不匹配，是检查这些相互作用性质的有力手段。雏鸡和两栖动物等生物分别为我们理解发育和再生做出了重要贡献，这在很大程度上是因为它们适合移植。然而，这些模型的力量受到遗传易处理性低的限制。同样，主要的遗传模式生物对移植的适应性较低。

斑马鱼是发育和再生的主要遗传模型，虽然细胞移植在斑马鱼中很常见，但它通常仅限于在囊胚和原肠发育的早期阶段转移未分化的细胞。在本文中，我们提出了一种简单而强大的方法，该方法将斑马鱼移植窗口扩展到受精后至少 1 到 7 天之间的任何胚胎或幼虫阶段。这种方法的精确性允许在供体和宿主动物中以近乎完美的空间和时间分辨率移植低至一个细胞。虽然我们在这里强调胚胎和幼虫神经元的移植分别用于研究神经发育和再生，但这种方法适用于广泛的祖细胞和分化细胞类型和研究问题。

Introduction

细胞移植作为发育生物学的基础技术有着悠久而传奇的历史。在 20^世纪之交，使用物理操作来扰乱发育过程的方法，包括移植，将胚胎学从观察科学转变为实验科学 ^1,2。在一项具有里程碑意义的实验中，Hans Spemann 和 Hilde Mangold 将蝾螈胚胎的背胚孔唇异位移植到宿主胚胎的另一侧，诱导附近的组织形成次级体轴³。该实验表明，细胞可以诱导其他细胞接受某些命运，随后，移植发展成为一种强大的方法，用于询问发育生物学中有关能力和细胞命运决定、细胞谱系、诱导能力、可塑性和干细胞效力的关键问题 ^1,4,5。

最近的科学进展扩大了移植方法的力量。1969 年，Nicole Le Douarin 发现核仁染色可以区分鹌鹑雏鸡嵌合体中的起源物种，从而可以追踪移植的细胞及其后代⁶。这一概念后来因转基因荧光标记物和先进成像技术的出现而得到加强⁵，并已被用于追....

Protocol

该程序与活体斑马鱼相关的所有方面均已获得明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准，并按照 IACUC 指南执行。

1. 移植装置的一次性初始设置（图 1）

1. 按照制造商的说明组装移植显微镜。
   注意：该协议使用具有 40 倍水浸物镜的正置荧光显微镜。
2. 组装粗略和精细的显?.......

Discussion

一个多世纪以来，发育和再生生物学一直依靠移植实验来研究细胞信号传导和细胞命运决定的原理。斑马鱼模型已经代表了遗传和移植方法的强大融合。在囊胚和原肠阶段移植以产生马赛克动物很常见，但它可以解决的问题类型有限。晚期移植很少见，尽管已经报道了分别以 16-18 hpf 和 30-33 hpf 移植胚胎脊髓运动神经元和视网膜神经节细胞的方法 26,27,28。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010