Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Здесь мы представляем протокол трансплантации клеток с высоким пространственным и временным разрешением эмбрионам и личинкам рыбок данио на любой стадии между как минимум 1 и 7 днями после оплодотворения.

Abstract

Развитие и регенерация происходят в процессе генетически закодированных пространственно-временных динамических клеточных взаимодействий. Использование трансплантации клеток между животными для отслеживания судьбы клеток и выявления несоответствий в генетических, пространственных или временных свойствах донорских и родительских клеток является мощным средством изучения природы этих взаимодействий. Такие организмы, как цыплята и амфибии, внесли решающий вклад в наше понимание развития и регенерации, соответственно, в значительной степени из-за их податливости к трансплантации. Однако мощность этих моделей была ограничена низкой генетической управляемостью. Аналогичным образом, основные генетические модельные организмы имеют меньшую податливость к трансплантации.

Данио рерио является основной генетической моделью развития и регенерации, и хотя трансплантация клеток распространена у рыбок данио, она, как правило, ограничена переносом недифференцированных клеток на ранних стадиях развития бластулы и гаструлы. В этой статье мы представляем простой и надежный метод, который продлевает окно трансплантации данио-рерио до любой эмбриональной или личиночной стадии между как минимум 1 и 7 днями после оплодотворения. Точность этого подхода позволяет проводить трансплантацию всего одной клетки с почти идеальным пространственным и временным разрешением как у доноров, так и у животных-хозяев. Несмотря на то, что мы выделяем здесь трансплантацию эмбриональных и личиночных нейронов для изучения развития и регенерации нервов, соответственно, этот подход применим к широкому спектру типов клеток-предшественников и дифференцированных клеток и исследовательских вопросов.

Introduction

Трансплантация клеток имеет долгую и легендарную историю как основополагающий метод в биологии развития. На рубеже20-го века подходы с использованием физических манипуляций для нарушения процесса развития, включая трансплантацию, превратили эмбриологию из наблюдательной науки вэкспериментальную. В одном из знаковых экспериментов Ганс Шпеман и Хильде Мангольд эктопически пересадили дорсальную бластопорную губу эмбриона саламандры на противоположную сторону эмбриона-хозяина, заставив близлежащую ткань сформировать вторичнуюось тела. Этот экспер....

Protocol

Все аспекты этой процедуры, относящиеся к работе с живыми рыбками данио, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Миннесоты и выполняются в соответствии с рекомендациями IACUC.

1. Однократная первичная настрой?.......

Representative Results

Результаты экспериментов по трансплантации непосредственно наблюдаются путем визуализации флуоресцентно меченых донорских клеток у животных-хозяев в соответствующие моменты времени после трансплантации с помощью флуоресцентного микроскопа. Здесь мы пересадили ?.......

Discussion

Биология развития и регенеративная биология уже более ста лет опирается на эксперименты по трансплантации для изучения принципов клеточной сигнализации и определения клеточной судьбы. Модель рыбок данио уже представляет собой мощное слияние генетического и трансп.......

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgements

Мы благодарим Сесилию Моэнс за обучение по трансплантации рыбок данио; Марк Тай за отличный уход за рыбами; и Эмме Карлсон за отзывы о рукописи. Эта работа была поддержана грантом NIH NS121595 A.J.I.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL "reservoir syringe"Fisher Scientific14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PESCorning431153
20 x 12 mm heating blockCorning480122
3-way stopcockBraun Medical Inc.455991
3 x 1 Frosted glass slideVWR48312-004
40x water dipping objectiveNikonMRD07420
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC3306
Coarse ManipulatorNarishigeMN-4
Custom microsyringe pumpUniversity of OregonN/AManufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"NikonN/A
electrode handleWorld Precision Instruments5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11VWR21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic NarishigeMMO-203
HEPES pH 7.2Sigma-AldrichH3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel HandleFisher Scientific12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 inDWK Life Sciences63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter DWK Life Sciences420408-0000
KimwipesKimberly-Clark Professional34120
Light Mineral OilSigma-AldrichM3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 VCorning6875SB
Manual microsyringe pumpWorld Precision InstrumentsMMPCommercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode HolderWorld Precision InstrumentsMPH310
MicroFil Pipette FillerWorld Precision InstrumentsMF28G67-5
Nail PolishElectron MIcroscopy Sciences72180
Nuclease-free waterVWR82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette PullerSutter InstrumentsP-97
Penicillin-streptomycinSigma-Aldrichp4458-100ML5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mLBel-Art37898-0000
Potassium chlorideSigma-AldrichP3911
Professional Super GlueLoctiteLOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test TubesFalcon352054
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888
Stage micrometerMeiji Techno AmericaMA285
Syringes without Needle, 50 mLBD Medical309635
Tricaine MethanosulfonateSyndel USASYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing lineBerkleyXLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205BD Medical427445
UltraPure Low Melting Point AgaroseInvitrogen16520050
Wiretrol II calibrated micropipettesDrummond50002010

References

  1. Solini, G. E., Dong, C., Saha, M. Embryonic transplantation experiments: Past, present, and future. Trends Dev Biol. 10, 13-30 (2017).
  2. Gilbert, S. F. . A Conceptual History of Modern Embryology. , (1991).
  3. Spemann, H., Mangold, H.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved