Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Здесь мы представляем протокол трансплантации клеток с высоким пространственным и временным разрешением эмбрионам и личинкам рыбок данио на любой стадии между как минимум 1 и 7 днями после оплодотворения.

Abstract

Развитие и регенерация происходят в процессе генетически закодированных пространственно-временных динамических клеточных взаимодействий. Использование трансплантации клеток между животными для отслеживания судьбы клеток и выявления несоответствий в генетических, пространственных или временных свойствах донорских и родительских клеток является мощным средством изучения природы этих взаимодействий. Такие организмы, как цыплята и амфибии, внесли решающий вклад в наше понимание развития и регенерации, соответственно, в значительной степени из-за их податливости к трансплантации. Однако мощность этих моделей была ограничена низкой генетической управляемостью. Аналогичным образом, основные генетические модельные организмы имеют меньшую податливость к трансплантации.

Данио рерио является основной генетической моделью развития и регенерации, и хотя трансплантация клеток распространена у рыбок данио, она, как правило, ограничена переносом недифференцированных клеток на ранних стадиях развития бластулы и гаструлы. В этой статье мы представляем простой и надежный метод, который продлевает окно трансплантации данио-рерио до любой эмбриональной или личиночной стадии между как минимум 1 и 7 днями после оплодотворения. Точность этого подхода позволяет проводить трансплантацию всего одной клетки с почти идеальным пространственным и временным разрешением как у доноров, так и у животных-хозяев. Несмотря на то, что мы выделяем здесь трансплантацию эмбриональных и личиночных нейронов для изучения развития и регенерации нервов, соответственно, этот подход применим к широкому спектру типов клеток-предшественников и дифференцированных клеток и исследовательских вопросов.

Introduction

Трансплантация клеток имеет долгую и легендарную историю как основополагающий метод в биологии развития. На рубеже20-го века подходы с использованием физических манипуляций для нарушения процесса развития, включая трансплантацию, превратили эмбриологию из наблюдательной науки вэкспериментальную. В одном из знаковых экспериментов Ганс Шпеман и Хильде Мангольд эктопически пересадили дорсальную бластопорную губу эмбриона саламандры на противоположную сторону эмбриона-хозяина, заставив близлежащую ткань сформировать вторичнуюось тела. Этот экспер....

Protocol

Все аспекты этой процедуры, относящиеся к работе с живыми рыбками данио, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Миннесоты и выполняются в соответствии с рекомендациями IACUC.

1. Однократная первичная настрой?.......

Representative Results

Результаты экспериментов по трансплантации непосредственно наблюдаются путем визуализации флуоресцентно меченых донорских клеток у животных-хозяев в соответствующие моменты времени после трансплантации с помощью флуоресцентного микроскопа. Здесь мы пересадили ?.......

Discussion

Биология развития и регенеративная биология уже более ста лет опирается на эксперименты по трансплантации для изучения принципов клеточной сигнализации и определения клеточной судьбы. Модель рыбок данио уже представляет собой мощное слияние генетического и трансп.......

Acknowledgements

Мы благодарим Сесилию Моэнс за обучение по трансплантации рыбок данио; Марк Тай за отличный уход за рыбами; и Эмме Карлсон за отзывы о рукописи. Эта работа была поддержана грантом NIH NS121595 A.J.I.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL "reservoir syringe"Fisher Scientific14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PESCorning431153
20 x 12 mm heating blockCorning480122
3-way stopcockBraun Medical Inc.455991
3 x 1 Frosted glass slideVWR48312-004
40x water dipping objectiveNikonMRD07420
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC3306
Coarse ManipulatorNarishigeMN-4
Custom microsyringe pumpUniversity of OregonN/AManufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"NikonN/A
electrode handleWorld Precision Instruments5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11VWR21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic NarishigeMMO-203
HEPES pH 7.2Sigma-AldrichH3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel HandleFisher Scientific12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 inDWK Life Sciences63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter DWK Life Sciences420408-0000
KimwipesKimberly-Clark Professional34120
Light Mineral OilSigma-AldrichM3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 VCorning6875SB
Manual microsyringe pumpWorld Precision InstrumentsMMPCommercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode HolderWorld Precision InstrumentsMPH310
MicroFil Pipette FillerWorld Precision InstrumentsMF28G67-5
Nail PolishElectron MIcroscopy Sciences72180
Nuclease-free waterVWR82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette PullerSutter InstrumentsP-97
Penicillin-streptomycinSigma-Aldrichp4458-100ML5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mLBel-Art37898-0000
Potassium chlorideSigma-AldrichP3911
Professional Super GlueLoctiteLOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test TubesFalcon352054
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888
Stage micrometerMeiji Techno AmericaMA285
Syringes without Needle, 50 mLBD Medical309635
Tricaine MethanosulfonateSyndel USASYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing lineBerkleyXLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205BD Medical427445
UltraPure Low Melting Point AgaroseInvitrogen16520050
Wiretrol II calibrated micropipettesDrummond50002010

References

  1. Solini, G. E., Dong, C., Saha, M. Embryonic transplantation experiments: Past, present, and future. Trends Dev Biol. 10, 13-30 (2017).
  2. Gilbert, S. F. . A Conceptual History of Modern Embryology. , (1991).
  3. Spemann, H., Mangold, H.

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved