A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Здесь мы представляем протокол трансплантации клеток с высоким пространственным и временным разрешением эмбрионам и личинкам рыбок данио на любой стадии между как минимум 1 и 7 днями после оплодотворения.
Развитие и регенерация происходят в процессе генетически закодированных пространственно-временных динамических клеточных взаимодействий. Использование трансплантации клеток между животными для отслеживания судьбы клеток и выявления несоответствий в генетических, пространственных или временных свойствах донорских и родительских клеток является мощным средством изучения природы этих взаимодействий. Такие организмы, как цыплята и амфибии, внесли решающий вклад в наше понимание развития и регенерации, соответственно, в значительной степени из-за их податливости к трансплантации. Однако мощность этих моделей была ограничена низкой генетической управляемостью. Аналогичным образом, основные генетические модельные организмы имеют меньшую податливость к трансплантации.
Данио рерио является основной генетической моделью развития и регенерации, и хотя трансплантация клеток распространена у рыбок данио, она, как правило, ограничена переносом недифференцированных клеток на ранних стадиях развития бластулы и гаструлы. В этой статье мы представляем простой и надежный метод, который продлевает окно трансплантации данио-рерио до любой эмбриональной или личиночной стадии между как минимум 1 и 7 днями после оплодотворения. Точность этого подхода позволяет проводить трансплантацию всего одной клетки с почти идеальным пространственным и временным разрешением как у доноров, так и у животных-хозяев. Несмотря на то, что мы выделяем здесь трансплантацию эмбриональных и личиночных нейронов для изучения развития и регенерации нервов, соответственно, этот подход применим к широкому спектру типов клеток-предшественников и дифференцированных клеток и исследовательских вопросов.
Трансплантация клеток имеет долгую и легендарную историю как основополагающий метод в биологии развития. На рубеже20-го века подходы с использованием физических манипуляций для нарушения процесса развития, включая трансплантацию, превратили эмбриологию из наблюдательной науки вэкспериментальную. В одном из знаковых экспериментов Ганс Шпеман и Хильде Мангольд эктопически пересадили дорсальную бластопорную губу эмбриона саламандры на противоположную сторону эмбриона-хозяина, заставив близлежащую ткань сформировать вторичнуюось тела. Этот экспер....
Все аспекты этой процедуры, относящиеся к работе с живыми рыбками данио, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Миннесоты и выполняются в соответствии с рекомендациями IACUC.
1. Однократная первичная настрой?.......
Результаты экспериментов по трансплантации непосредственно наблюдаются путем визуализации флуоресцентно меченых донорских клеток у животных-хозяев в соответствующие моменты времени после трансплантации с помощью флуоресцентного микроскопа. Здесь мы пересадили ?.......
Биология развития и регенеративная биология уже более ста лет опирается на эксперименты по трансплантации для изучения принципов клеточной сигнализации и определения клеточной судьбы. Модель рыбок данио уже представляет собой мощное слияние генетического и трансп.......
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Мы благодарим Сесилию Моэнс за обучение по трансплантации рыбок данио; Марк Тай за отличный уход за рыбами; и Эмме Карлсон за отзывы о рукописи. Эта работа была поддержана грантом NIH NS121595 A.J.I.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 mL "reservoir syringe" | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES | Corning | 431153 | |
20 x 12 mm heating block | Corning | 480122 | |
3-way stopcock | Braun Medical Inc. | 455991 | |
3 x 1 Frosted glass slide | VWR | 48312-004 | |
40x water dipping objective | Nikon | MRD07420 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C3306 | |
Coarse Manipulator | Narishige | MN-4 | |
Custom microsyringe pump | University of Oregon | N/A | Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below. |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 1129500 | |
Eclipse FN1 "Transplant Microscope" | Nikon | N/A | |
electrode handle | World Precision Instruments | 5444 | |
Feather Sterile Surgical Blade, #11 | VWR | 21899-530 | |
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic | Narishige | MMO-203 | |
HEPES pH 7.2 | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
High Precision #3 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-163 | |
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in | DWK Life Sciences | 63A53WT | |
KIMBLE Chromatography Adapter | DWK Life Sciences | 420408-0000 | |
Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
Light Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516-1L | |
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V | Corning | 6875SB | |
Manual microsyringe pump | World Precision Instruments | MMP | Commercial alternative to custom microsyringe pump |
Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
MicroFil Pipette Filler | World Precision Instruments | MF28G67-5 | |
Nail Polish | Electron MIcroscopy Sciences | 72180 | |
Nuclease-free water | VWR | 82007-334 | |
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | p4458-100ML | 5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL |
pipette pump 10 mL | Bel-Art | 37898-0000 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Professional Super Glue | Loctite | LOC1365882 | |
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes | Falcon | 352054 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Stage micrometer | Meiji Techno America | MA285 | |
Syringes without Needle, 50 mL | BD Medical | 309635 | |
Tricaine Methanosulfonate | Syndel USA | SYNCMGAUS03 | |
Trilene XL smooth casting Fishing line | Berkley | XLFS6-15 | |
Tubing, polyethylene No. 205 | BD Medical | 427445 | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
Wiretrol II calibrated micropipettes | Drummond | 50002010 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved