ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית של מיון חלבונים לפלסמודסמאטה בניקוטיאנה בנטמיאנה

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הבחירה של סמנים פלסמודסמליים אופטימליים עבור ניתוחים מבוססי מיקרוסקופיה קונפוקלית של מיקוד חלבונים לפלסמודסמאטה במהלך אינטראקציות וירוס-פלסמודסמאטה או הובלה פלסמודסמלית.

Abstract

פלסמודסמאטה הן ננו-נקבוביות קרומיות המחברות את הציטופלסמה של תאי צמח סמוכים ומאפשרות מעבר בין תאים של חומרי מזון, מקרומולקולות וכן וירוסים פולשים. פלסמודסמאטה ממלאת תפקידים בסיסיים בוויסות התקשורת הבין-תאית, ותורמת להתפתחות צמחים, תגובות סביבתיות ואינטראקציות עם פתוגנים נגיפיים. גילוי לוקליזציה פלסמודזמלית של חלבונים צמחיים או נגיפיים יכול לספק מידע פונקציונלי שימושי על החלבון, והוא חשוב להבנת המנגנונים של אינטראקציות צמחים-וירוסים. כדי להקל על מחקרים אלה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית של חלבוני מיקוד פלסמודסמליים שונים כדי לבחור את הסמן הפלסמודסמלי הטוב ביותר לחקר אינטראקציות וירוס-פלסמודסמאטה או הובלה פלסמודסמלית. באופן ספציפי, הניתוחים של אירועים אלה מודגמים באמצעות חלבון תנועת תא לתא (MP) של וירוס ניקוי ורידים לפת (TVCV), Arabidopsis Plasmodesmata-Localized Protein 5 (PDLP5) וחלבון קושר פלסמודסמאטה קלוז 1 (PDCB1). נתוני הלוקליזציה של חלבונים מנותחים במקביל להדמיה הגלובלית של פלסמודסמאטה באמצעות צביעה כחולה אנילין של הרקמות שנדגמו. גישות אלה יכולות להיות מותאמות בקלות כדי לנתח את הלוקליזציה פלסמודזמלית של כל חלבונים תאיים או פתוגניים בצמח.

Introduction

פלסמודסמאטה (PD) ממלאת תפקיד בסיסי בבקרת התפתחות צמחים, תגובות סביבתיות ואינטראקציות עם פתוגנים נגיפיים באמצעות ויסות התקשורת הבין-תאית ^1,2. פרקינסון נוצר בתחילה במהלך ציטוקינזיס, כאשר מאות פרקינסון מוחדרים לתא החדש בין שני תאי הבת, ובכך מספקים את התעלות לתקשורת בין תאים ^3,4. PD הוא מבנה עשיר בקרום, המכיל את הממברנה הנגזרת מהרשתית האנדופלסמית (ER), desmotubule trans-PD, בחלק המרכזי של הנקבוביות המרופדות על ידי קרום פלזמה ^3,4. גישות פרוטאומיות השוואתיות זיהו חלב....

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. גידול צמחים

1. לגדל זרעי Nicotiana benthamiana באדמה רטובה בתא סביבה מבוקרת ב 23 °C (75 °F) תחת 16 שעות של אור ו 8 שעות של חושך.
2. לאחר כשבועיים, מעבירים בזהירות את השתילים עם כדורי ?.......

Discussion

כל מחקר ביולוגי של התא על תקשורת בין-תאית של צמחים והעברה בין תאים במהלך התפתחות נורמלית של צמחים ומורפוגנזה, כמו גם במהלך אינטראקציות צמחים-פתוגנים, מחייב זיהוי וניטור של מיון חלבונים - הן אנדוגניים והן מקודדים פתוגנים - לקשרים בין-תאיים צמחיים, פלסמודסמאטה (PD). ניסויים א.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABT AC 1 phase motor	BRANDTECH	ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control	CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	GraphPad Software Inc.
Image J	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Plant species
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	#M0491S