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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo descreve a seleção de marcadores plasmodésmicos ideais para análises baseadas em microscopia confocal de direcionamento de proteínas para plasmodesmos durante interações vírus-plasmodesmos ou transporte plasmodesmal.

Abstract

Plasmodesmos são nanoporos membranosos que conectam o citoplasma de células vegetais adjacentes e permitem o tráfego célula a célula de nutrientes, macromoléculas, bem como vírus invasores. Os plasmodesmos desempenham papéis fundamentais na regulação da comunicação intercelular, contribuindo para o desenvolvimento das plantas, respostas ambientais e interações com patógenos virais. A descoberta da localização plasmodésmica de proteínas vegetais ou virais pode fornecer informações funcionais úteis sobre a proteína e é importante para a compreensão dos mecanismos das interações planta-vírus. Para facilitar esses estudos, descrevemos um protocolo para análise baseada em microscopia confocal de diferentes proteínas de direcionamento plasmodesmal para selecionar o melhor marcador plasmodesmal para estudar as interações vírus-plasmodesmos ou transporte plasmodesmal. Especificamente, as análises desses eventos são ilustradas usando a proteína de movimento célula a célula (MP) do vírus de limpeza da veia do nabo (TVCV), a proteína localizada em plasmodesmos de Arabidopsis 5 (PDLP5) e a proteína de ligação à calose de plasmodesmos 1 (PDCB1). Os dados de localização plasmodésica da proteína são analisados em paralelo com a visualização global dos plasmodesmos usando coloração com azul de anilina dos tecidos amostrados. Essas abordagens podem ser facilmente adaptadas para analisar a localização plasmodésmica de qualquer proteína celular ou patogênica na planta.

Introduction

Os plasmodesmos (PD) desempenham um papel fundamental no controle do desenvolvimento vegetal, respostas ambientais e interações com patógenos virais por meio da regulação da comunicação intercelular 1,2. A DP se forma inicialmente durante a citocinese, com centenas de PD inseridas na nova célula entre as duas células-filhas, fornecendo assim os canais para a comunicação célula a célula 3,4. A DP é uma estrutura rica em membrana, contendo a membrana derivada do retículo endoplasmático (RE), um desmotúbulo trans-PD, na p....

Protocol

Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Crescimento das plantas

  1. Cultive sementes de Nicotiana benthamiana em solo úmido em uma câmara de ambiente controlado a 23 ° C sob 16 h de luz e 8 h de escuridão.
  2. Após cerca de 2 semanas, transfira cuidadosamente as mudas com os pellets de turfa ao redor de suas raízes para vasos mai.......

Representative Results

Para facilitar os estudos da função da DP na fisiologia vegetal e nas interações com patógenos, três proteínas de referência simples e confiáveis foram desenvolvidas para a localização da DP. Duas proteínas PD celulares e uma proteína MP derivada do patógeno codificada pelo tobamovírus vegetal TVCV foram selecionadas. A localização subcelular dessas proteínas foi visualizada usando um repórter autofluorescente EGFP fundido ao terminal C de cada proteína. Em uma aborda.......

Discussion

Quaisquer estudos biológicos celulares de comunicação intercelular de plantas e transporte célula a célula durante o desenvolvimento e morfogênese normais da planta, bem como durante as interações planta-patógeno, requerem a detecção e monitoramento da classificação de proteínas - endógenas e codificadas por patógenos - para conexões intercelulares de plantas, os plasmodesmos (PD). Esses experimentos seriam substancialmente facilitados pelo uso de proteínas de referênc.......

Acknowledgements

O trabalho no laboratório VC foi apoiado por doações do NIH (R35GM144059), NSF (MCB 1913165 e IOS 1758046) e BARD (IS-5276-20) para VC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e interpretação de dados, ou na decisão de publicar.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ABT AC 1 phase motorBRANDTECH ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.GraphPad Software Inc.
Image JNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscopeZeissLSM 900
Nicotiana benthamianaPlant species
pDONR207Invitrogen#12213013
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNEB#M0491S

References

  1. Lee, J., et al. A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis. The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).
  2. Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J.

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