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Este protocolo descreve a seleção de marcadores plasmodésmicos ideais para análises baseadas em microscopia confocal de direcionamento de proteínas para plasmodesmos durante interações vírus-plasmodesmos ou transporte plasmodesmal.
Plasmodesmos são nanoporos membranosos que conectam o citoplasma de células vegetais adjacentes e permitem o tráfego célula a célula de nutrientes, macromoléculas, bem como vírus invasores. Os plasmodesmos desempenham papéis fundamentais na regulação da comunicação intercelular, contribuindo para o desenvolvimento das plantas, respostas ambientais e interações com patógenos virais. A descoberta da localização plasmodésmica de proteínas vegetais ou virais pode fornecer informações funcionais úteis sobre a proteína e é importante para a compreensão dos mecanismos das interações planta-vírus. Para facilitar esses estudos, descrevemos um protocolo para análise baseada em microscopia confocal de diferentes proteínas de direcionamento plasmodesmal para selecionar o melhor marcador plasmodesmal para estudar as interações vírus-plasmodesmos ou transporte plasmodesmal. Especificamente, as análises desses eventos são ilustradas usando a proteína de movimento célula a célula (MP) do vírus de limpeza da veia do nabo (TVCV), a proteína localizada em plasmodesmos de Arabidopsis 5 (PDLP5) e a proteína de ligação à calose de plasmodesmos 1 (PDCB1). Os dados de localização plasmodésica da proteína são analisados em paralelo com a visualização global dos plasmodesmos usando coloração com azul de anilina dos tecidos amostrados. Essas abordagens podem ser facilmente adaptadas para analisar a localização plasmodésmica de qualquer proteína celular ou patogênica na planta.
Os plasmodesmos (PD) desempenham um papel fundamental no controle do desenvolvimento vegetal, respostas ambientais e interações com patógenos virais por meio da regulação da comunicação intercelular 1,2. A DP se forma inicialmente durante a citocinese, com centenas de PD inseridas na nova célula entre as duas células-filhas, fornecendo assim os canais para a comunicação célula a célula 3,4. A DP é uma estrutura rica em membrana, contendo a membrana derivada do retículo endoplasmático (RE), um desmotúbulo trans-PD, na p....
Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Crescimento das plantas
Para facilitar os estudos da função da DP na fisiologia vegetal e nas interações com patógenos, três proteínas de referência simples e confiáveis foram desenvolvidas para a localização da DP. Duas proteínas PD celulares e uma proteína MP derivada do patógeno codificada pelo tobamovírus vegetal TVCV foram selecionadas. A localização subcelular dessas proteínas foi visualizada usando um repórter autofluorescente EGFP fundido ao terminal C de cada proteína. Em uma aborda.......
Quaisquer estudos biológicos celulares de comunicação intercelular de plantas e transporte célula a célula durante o desenvolvimento e morfogênese normais da planta, bem como durante as interações planta-patógeno, requerem a detecção e monitoramento da classificação de proteínas - endógenas e codificadas por patógenos - para conexões intercelulares de plantas, os plasmodesmos (PD). Esses experimentos seriam substancialmente facilitados pelo uso de proteínas de referênc.......
Os autores declaram não haver interesses conflitantes.
O trabalho no laboratório VC foi apoiado por doações do NIH (R35GM144059), NSF (MCB 1913165 e IOS 1758046) e BARD (IS-5276-20) para VC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e interpretação de dados, ou na decisão de publicar.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
ABT AC 1 phase motor | BRANDTECH | ABF63/4C-7RQ | |
Agrobacterium tumefaciens EHA105 | |||
Contamination control | CCI | ||
Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | #11789020 | |
Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | #11791020 | |
GraphPad Prism 8.0.1. | GraphPad Software Inc. | ||
Image J | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | ||
Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 900 | |
Nicotiana benthamiana | Plant species | ||
pDONR207 | Invitrogen | #12213013 | |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | #M0491S |
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