Análise por microscopia confocal da classificação de proteínas para plasmodesmos em Nicotiana benthamiana

Summary

Este protocolo descreve a seleção de marcadores plasmodésmicos ideais para análises baseadas em microscopia confocal de direcionamento de proteínas para plasmodesmos durante interações vírus-plasmodesmos ou transporte plasmodesmal.

Abstract

Plasmodesmos são nanoporos membranosos que conectam o citoplasma de células vegetais adjacentes e permitem o tráfego célula a célula de nutrientes, macromoléculas, bem como vírus invasores. Os plasmodesmos desempenham papéis fundamentais na regulação da comunicação intercelular, contribuindo para o desenvolvimento das plantas, respostas ambientais e interações com patógenos virais. A descoberta da localização plasmodésmica de proteínas vegetais ou virais pode fornecer informações funcionais úteis sobre a proteína e é importante para a compreensão dos mecanismos das interações planta-vírus. Para facilitar esses estudos, descrevemos um protocolo para análise baseada em microscopia confocal de diferentes proteínas de direcionamento plasmodesmal para selecionar o melhor marcador plasmodesmal para estudar as interações vírus-plasmodesmos ou transporte plasmodesmal. Especificamente, as análises desses eventos são ilustradas usando a proteína de movimento célula a célula (MP) do vírus de limpeza da veia do nabo (TVCV), a proteína localizada em plasmodesmos de Arabidopsis 5 (PDLP5) e a proteína de ligação à calose de plasmodesmos 1 (PDCB1). Os dados de localização plasmodésica da proteína são analisados em paralelo com a visualização global dos plasmodesmos usando coloração com azul de anilina dos tecidos amostrados. Essas abordagens podem ser facilmente adaptadas para analisar a localização plasmodésmica de qualquer proteína celular ou patogênica na planta.

Introduction

Os plasmodesmos (PD) desempenham um papel fundamental no controle do desenvolvimento vegetal, respostas ambientais e interações com patógenos virais por meio da regulação da comunicação intercelular ^1,2. A DP se forma inicialmente durante a citocinese, com centenas de PD inseridas na nova célula entre as duas células-filhas, fornecendo assim os canais para a comunicação célula a célula ^3,4. A DP é uma estrutura rica em membrana, contendo a membrana derivada do retículo endoplasmático (RE), um desmotúbulo trans-PD, na p....

Protocol

Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Crescimento das plantas

1. Cultive sementes de Nicotiana benthamiana em solo úmido em uma câmara de ambiente controlado a 23 ° C sob 16 h de luz e 8 h de escuridão.
2. Após cerca de 2 semanas, transfira cuidadosamente as mudas com os pellets de turfa ao redor de suas raízes para vasos mai.......

Discussion

Quaisquer estudos biológicos celulares de comunicação intercelular de plantas e transporte célula a célula durante o desenvolvimento e morfogênese normais da planta, bem como durante as interações planta-patógeno, requerem a detecção e monitoramento da classificação de proteínas - endógenas e codificadas por patógenos - para conexões intercelulares de plantas, os plasmodesmos (PD). Esses experimentos seriam substancialmente facilitados pelo uso de proteínas de referênc.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABT AC 1 phase motor	BRANDTECH	ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control	CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	GraphPad Software Inc.
Image J	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Plant species
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	#M0491S