11.18 : Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi: Elüsyon İşlemi

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisinde (HPLC), elüsyon işlemi analitlerin ayrılması ve kromatografik sonuçların kalitesi için kritik öneme sahiptir. Elüsyon, bileşiklerin kolondan nasıl geçtiğini ve hareketli ve sabit fazlarla etkileşimlerine göre nasıl ayrıldığını açıklar. Bu işlem, karmaşık karışımlardaki bileşenleri tanımlamak ve ölçmek için gerekli olan kromatogramdaki çözünürlüğü, tepe şeklini ve tutulma sürelerini belirler. Elüsyon işlemini anlamak, kromatografik verilerin yorumlanmasına ve ayırma verimliliğinin iyileştirilmesine yardımcı olur.

HPLC, safsızlıklardan kaynaklanan minimum müdahaleyi sağlamak için son derece saf HPLC sınıfı çözücüler kullanır. Yüksek sınıf çözücüler önemlidir çünkü eser miktarda kirletici bile elüsyon işlemine müdahale edebilir, kromatogram tepelerini bozabilir ve numune tespiti sırasında hassasiyeti azaltabilir. Ayrıca, çözücüler azot ve oksijen gibi çözünmüş gazlar içerebilir ve bu da numune tespitine müdahale edebilir. Gaz giderme, ayırma ve algılama süreçlerinin bütünlüğünü korumak için vakum pompası veya helyum gazıyla temizleme kullanılarak bu gazları ortadan kaldırmak için kullanılır.

Gazdan arındırılmış çözücüler daha sonra hareketli faz rezervuarından yüksek basınçlı bir pompa ile çekilir; en yaygın kullanılan pompa ise alternatif pompadır. Pompa, pistonun ileri geri hareketini kullanarak çözücüyü çeken bir piston ve iki çek valfinden oluşur. Ancak alternatif pompanın bir dezavantajı, darbeli bir çözücü akışı üretmesidir. Bu nedenle, modern HPLC sistemlerinde bu sorunu ele almak için pompaya bağlı bir darbe sönümleyici bulunur. Vida tahrikli deplasman pompaları gibi diğer pompalar da mevcuttur ancak daha az çözücü kapasitesi ve düşük basınç taşıma kapasitesi gibi sınırlamaları olabilir; bu da çözücü değişimleri için onları daha az kullanışlı hale getirir.

İki tür elüsyon süreci vardır: izokratik ve gradyan elüsyonu. İzokratik elüsyon, ayırma boyunca tek bir çözücü veya hareketli faz kullanırken, gradyan elüsyonu ayırma işlemi sırasında bileşimde bir değişiklik içerir. Bu yöntem ayırma verimliliğini artırır, analiz süresini azaltır ve çözünürlüğü geliştirerek kromatogramda daha keskin tepe noktalarına yol açar. Gradyan elüsyonu daha iyi çözünürlük sağlar ve daha belirgin ve ayrılmış tepe noktalarıyla sonuçlanarak izokratik elüsyona kıyasla karmaşık karışımlar için kromatogramın yorumlanmasını kolaylaştırır.

Mobil faz kolona girmeden önce, numune iki konumlu bir valfe sahip bir döngü enjektörü kullanılarak sokulur. Valf, mobil fazın kolona yönlendirilmesine yardımcı olur. HPLC'deki yüksek basınç nedeniyle, gaz kromatografisinde (GC) olduğu gibi numune enjeksiyonu yapılamaz. 0,5 mikrolitreden 2 mililitreye kadar değişen sabit hacimlere sahip örnekleme döngüleri birbirinin yerine kullanılabilir.