Drosophila Larvaların NMJ İmmünohistokimya

Özet

Bu protokol disseke Drosophila larva immünohistokimya nasıl gerçekleştirileceği göstermektedir.

Özet

Protokol

Başlamadan önce

1. Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: PBT (1X PBS içinde% 0.1 Triton X 100), PBTB (% 0.2 PBT olarak BSA) ve PBTN (2 PBTB% NGS).
2. Drosophila larvaları parçalara ayır. Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon bakınız.

İmmünohistokimya

1. PBT içeren 1.5 ml tüp larvaları taşıyın. Larvaların PBT 15 dakika boyunca iki kez yıkayın. Not: yıkamak, bir nutator karıştırıcı 1.5 ml tüp yerleştirin. Pippetor ile sıvı çıkarın ve temiz sıvı ile değiştirin.
2. PBT çıkarın. 30 dakika boyunca iki kez PBTB yıkayın.
3. PBTB çıkarın. 15 dakika boyunca iki kez PBTN yıkayın.
4. 1 saat veya gece boyunca 4 º C'de oda sıcaklığında PBTN içinde seyreltilmesi birincil antikor inkübe edin.
5. PBTB iki kez durulayın. Not: eklemek yıkama sıvısı ve hızlı bir şekilde kaldırmak için.
6. PBTB 15 dakika için iki kez yıkayın.
7. PBTN 30 dakika süreyle yıkayın.
8. PBTN içinde seyreltilmiş sekonder antikor (konjuge primer antikor birini kullanıyorsanız) inkübe edin.
9. Kalay ve oda sıcaklığında 1,5 saat süreyle inkübe Kapak.
10. PBTB iki kez durulayın.
11. PBTB ile 15 dakika boyunca iki kez yıkayın.
12. Montaj geçin.

Montaj

Not: örnekleri hemen görüntülü edilecektir gliserol Dağı. Altın Prolong Dağı örnekleri görüntüleme önce saklanabilir (bir haftadan fazla) veya numune birden çok kez görüntülenmiş olması gerekir. Kullanmak için, 2-3 dakika süreyle 65 º C su banyosunda uzatmak bir şişe yerleştirin. Altın Prolong bir kısım atın ve 45-50 º C'de bir ısı bloğu üzerinde tutmak

1. PBT bir saat cam vitray preparatlarıyla dökün.
2. Işlem için temiz bir cam slayt bazı gliserol koyun.
3. Forseps kullanarak bir köşesinde saat camı onları toplama, işleme slayt hayvanların hareket ettirin. Onlar aşağı manikür tarafında olduğundan emin olun.
4. Işleme cam slayt taze bir jilet ile baş ve kuyruk çıkarın. # 16 bıçak ile bir exacto-bıçak, bunun için iyi çalışır.
5. Başka bir slayt (slayt montaj), gliserol küçük bir damla koymak / temiz forseps ile uzatmak ve yaymak.
6. Onlara ters özen, kendi kenarına montaj slayt disseke hayvanların hareket ettirin. Aynı yönde satır mount deneyin. Mount slayt başına 6-8 hayvan.
7. Bir kapak kayma Prolong / gliserol bir kenar yerleştirerek ve yavaşça serbest bırakın.
8. Tırnak cilası ile slayt Seal. Not [vernik kuruyana kadar görüntü vermeyin. Bu genellikle on dakika sürer. Uzatmak altın monte örnekleri için, slaytlar, mühürleme ya da görüntüleme en az üç saat önce kurumasını bekleyin.]

Tartışmalar

NMJ görselleştirme sağlar çünkü immünhistokimyasal (İHK) NMJ biyoloji çalışması için hayati önem taşımaktadır. Bu nöronal membran (örneğin, HRP), presynapse (örneğin, CSP, SYT) ve / veya postsynapse (örneğin, DLG) tanıyan antikorlar kullanılarak yapılır. Sinyal molekülleri, yapısal protein, ya da ilgi roman proteinlerin de lekeli olabilir. Sonra, genler mutasyona uğramış veya missexpressed ve İHK sinaptik yapısı ve / veya nöronal sinyal pertürbasyon tespit edilebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope “Stemi” 2000	Carl Zeiss, Inc.	495101-9804-000
Light Source KL 1500 LCD	Carl Zeiss, Inc.	000000-1063-181
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools	11200-33
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Adams™ Nutator Mixer	BD Biosciences	421105
No.1 Precision knife	X-Acto	3201
No. 16 Blades	X-Acto	216
ProLong Gold Antifade reagent	Invitrogen	36930