Astrositler Plazma Membran ve Küresel Hücre içi kalsiyum Dynamics civarında Ölçüm

Özet

Biz toplam iç yansıma ve Epifloresans mikroskopi kullanılarak kültürlü astrositler membran ve küresel hücre içi kalsiyum dinamikleri yakın ölçmek için nasıl açıklar.

Özet

Beyin glial hücreler içerir. Astrositler, glial hücre tipi, uzun nöronlar için pasif bir destekleyici bir rol sağlamak için bilinmektedir. Ancak, artan kanıtlar astrositler nöronlar ile fonksiyonel etkileşim yoluyla da aktif beyin fonksiyonu katılmak olabileceğini düşündürmektedir. Ancak, birçok temel yönleri astrosit biyoloji, tartışmalı, belirsiz ve / veya deneysel keşfedilmemiş kalır. Bir önemli konu astrositlerde hücre içi kalsiyum Transientlerin dinamikleri. Kalsiyum önemli bir ikinci haberci olarak iyi kurulmuş ve çünkü astrosit kalsiyum yükselmeler astrositler gelen vericileri serbest bırakılması tetikleyebilir ileri sürülmektedir çünkü bu geçerlidir. Ancak, yakın plazma membranı kalsiyum astrositler sinyal herhangi bir ayrıntılı ve tatmin edici bir açıklama olmamıştır. Toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi canlı hücrelerinin plazma membranı yaklaşık 100 nm içinde önemli fizyolojik sinyalleme olaylarını analiz etmek için güçlü bir araçtır. Burada, TIRF mikroskobu kullanımı ve neredeyse aynı anda, plazma membranı ve küresel hücre içi kalsiyum dinamikleri yakın izlemek nasıl tarif. Bu yaklaşımın daha rafine ve sistematik bir uygulama astrosit kalsiyum sinyal kesin detaylar hakkında bilgi potansiyeline sahiptir. Astrosit kalsiyum dinamiklerinin ayrıntılı bir anlayış, nasıl, ne zaman ve neden astrositler ve nöron kalsiyum-bağımlı fonksiyonel etkileşimleri tabi anlamak için bir temel sağlayabilir.

Protokol

DENEYSEL PROSEDÜRLER

Deneysel işlemin bir adım daha akıllıca bir şekilde aşağıda açıklanan iki ana bölümden oluşmaktadır.

Bölüm 1: HAZIRLAMA hipokampal astrosit KÜLTÜRLER

Kısaca, karışık, hipokampal astrosit nöron kültürleri iyi kurulmuş ^bir protokol 1,2,3 kullanılarak hazırlanmıştır. Prosedürü, sağlıklı kültürlü astrositler verim için optimize edilmiş. Aşağıda listelenen tüm işlemler, steril bir ortamda böyle bir laminer akış kaputu gibi yapılmalıdır.

Hazırlanması lamelleri

• 22 mm lamelleri (VWR, 48.380-068)
• Poly-D-Lizin (PDL, Sigma P0899), alikotları (1 mg / ml)
• Laminin alikotları (20 mg / ml): 1 mg / ml laminin solüsyonu (Sigma L2020) ile 49 ml steril su ekleyin, -20 ° C'de 1.2 ml alikotları ve mağaza

1. (50 mg / ml) steril su PDL çözülür
2. Lamelleri Otoklav, PDL steril su ve yeri (100 lamelleri için 20 ml) ile durulayın. Gece boyunca oda sıcaklığında bekletin.
3. PDL steril su ile (3 geniş yıkar) değiştirin. Sonra 4 lamelleri ve mağaza ° C kuru
4. 6 plaka (Steril Bioscience BD Kapaklar multiwell Düz Tabanlı Tabaklar) steril bir kuyu astrositler, bireysel lamelleri kaplama bir gün önce. Her lamel laminin ul 400 koyun ve buharlaşmasını önlemek için inkübatör, gece inkübe edin.

Diseksiyon

Diseksiyon medya:

• 500 ml Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) (1X), sıvı (Invitrogen, 14.155-063)
• 5 ml Hepes solüsyonu (Sigma, H0887)

Hipokampal medya:

• 412,5 ml Minimum Essential Medium (MEM) (1X), sıvı Earle Kullanıcı tuz içerir, ancak hiçbir L-glutamin veya fenol kırmızısı (Invitrogen, 51.200-038)
• 10 ml glikoz (Sigma, D-(+) GLİKOZ susuz SIGMA ULTRA G7528) 1 M MEM
• 5 ml Penisilin-Streptomisin (Invitrogen, 15.140-122)
• 5 ml sodyum piruvat çözüm (Sigma, S8636)
• 12.5 ml Hepes çözüm 1 M (Sigma, H0887)
• 5 ml N-2 Eki (100X), sıvı (Invitrogen, 17.502-048)
• 50 ml At Serum, Isı-İnaktive (Invitrogen, 26.050-088)

Papain çözüm:

• Worthington papain-022 flakon (LK003178; nihai konsantrasyonu, 20 U / ml), diseksiyon medya 5 ml ve 37 ° C 60 dakika inkübe edin.

1. P1 (genellikle 2 yavrular) ulusal düzenlemeler ve yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve onaylanan yönergeleri izleyerek yaşlı sıçan yavrular başını kesmek.
2. Petri kabındaki soğuk diseksiyon medya ile doldurulmuş deri ve kafatası yer ve beyin çıkarın.
3. Meninksler kaldırıldı, her iki yarımkürede incelemek ve hippocampi teşrih.
4. Hippocampi ~ 37 ° papain çözüm 1X1 mm parçaları ve hazmı ° C 11-13 dakika süreyle içine doğrayın.
5. Doku parçaları yerleştikten sonra, kaldırmak dikkatle papain ve enzim bütün izlerini kaldırmak için 5 ml hipokampal orta eklemek. Hipokampal orta (2 ml) ve bu adımı tekrar süspansiyon tekrarlayın.
6. Kümeleri, üç aşamalı olarak küçük delikleri (1000 mm, ~ 500 mm ~ 300 mikron) alev cilalı pipetler sol kalmayana dek hücreleri ~ 5 kez Karışım.
7. Triturated sonra, bir hücre süzgeç (gözenek boyutu, 70 mikron, BD Bioscience) aracılığıyla hücrelere geçerler. 10 ul süspansiyon hücreleri saymak. 400.000 hücre / ml sahip amacıyla hipokampal ortamın ses seviyesini ayarlayın.
8. Lamelleri kapalı laminin aspire ve lamel başına hücre süspansiyonu kapakları kuru önce, plaka 200 ul.
9. Onları inkübatörde 60 dakika ekleyiniz ve sonra iyi ortalama 2 ml hipokampal orta eklemek bırakın.
10. Ertesi gün, ölü hücreleri ve enkaz kaldırma ve 2 ml, önceden ısıtılmış taze hipokampal orta eklemek için eski hipokampal orta aspirat.

Bakım

Neurobasal medya:

• 500 ml neurobasal (Invitrogen, 12.348-017)
• 10 ml B27 serum serbest eki (Invitrogen, 17.504-044)
• 5 ml Penisilin-Streptomisin (Invitrogen, 15.140-122)
• 1.25 ml L-glutamin (Invitrogen, 25.030-149)

Kaplama dört gün sonra başlayan, neurobasal orta astrosit-nöron kültürler haftada iki kez besleyin. Sıcaklık ve CO ₂ denge sağlaması için yaklaşık 30 dakika havalandırılan bir balonuna inkübatör medya Preincubate.

Bölüm 2: KALSİYUM GÖRÜNTÜLEME

Hipokampal kayıt tampon: 110 mM NaCl, 5.4 mMKCl, 1.8 mM CaCl _2, 0.8 mM MgCl _2, 10 mM D-glukoz, 10 mM HEPES (Sigma tüm kimyasallar), pH 7.4 (NaOH ile düzeltilmiş) .

Astrositler kalsiyum göstergesi boya yükleme

1. 2 ml hipokampal kayıt tampon DMSO 2.5 mcM Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14.217) ve% 0.05 Pluronic ® F-127% 20 çözüm içeren dolu bir 6-plaka (Invitrogen, iyi bir kültür koyun P-3000MP) ve 10-30 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin.
2. Fluo-4 çözüm çıkarın ve 30 dakika oda sıcaklığında hipokampal kayıt tampon ve inkübe ile lamelleri 3 kere yıkayın.
3. Lamel odasına yerleştirin ve lens temizleme sıvı ile lamel diğer tarafında temiz.
4. Amaç küçük bir damla immersiyon yağı (Cargille Immersion Yağı TİPİ DF) koyun ve mikroskop (Olympus IX71) sahne odası (25 mm yuvarlak lamel için Warner Instruments Açık odası) koymak.
5. Iletim ışık kullanarak hücreleri hücrelerin nasıl göründüğüne bakmak ve onları almak için odak noktası haline bakın. Sonra (Vizyon KADAR Polychrome V) monokromatör gelen 488 nm hücreleri aydınlatmak ve Fluo-4 floresan sinyal üniforma ve astrositler saptanabilir olup olmadığını belirlemek.
6. EPI ve TIRF aydınlatma astrositler kalsiyum ölçmek için kullanın.

TIRF mikroskopi

Kısaca, biz bir Andor IXON DV887DCS EMCCD kamera ile donatılmış bir Olympus IX71 mikroskop kullanıyoruz. Eksitasyon ve görüntü alımı kontrolü TILLVision yazılımı kullanılarak elde edilir. 454/488/515 nm Argon (100 mW) ve 442 nm (45 mW) katı hal lazerleri kirişler kombine ve kontrollü bir KADAR Polyline lazer birleştirici, TIRF çift bağlantı kondansatör ve acoustoptical arasında ayarlanabilir filtre ve denetleyicisi (AOTF tüm TIRF kondenser içine giriş için Kineflex geniş bant fiber içine Fotonik) ve beslenen KADAR. Biz TIRF elde etmek için Olympus 60X 1.45 NA lens kullanın. Kamera kazancı en iyi sinyal-gürültü görüntüleri sağlamak için her astrosit ayarlanır. Arka plan ve TIRF mikroskopi ^ilkeleri, son ^{zamanlarda, 5} 4 gözden geçirilmiştir . Kullandığımız optik bileşenlerin çoğu şimdi Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/) bir parçası Fotonik, KADAR satın alındı. TIR penetrasyon derinliği aşağıdaki denklemler hesaplanabilir.

d = penetrasyon derinliği

n1 = cam kırılma indisi

n2 = kırılma indisi hücre

insidansı = açısı

NAI = sayısal açıklık insidansı

Lazer TIRF için optimal aynı hizada olmasını sağlamak için 100 nm floresan boncuk (Invitrogen, F8803) gözlemlemek için yararlı bulabilirsiniz. Biz hala EPI ve TIRF mikroskopi ile boncuk çerçeveleri ve videoları mevcut. Zaman TIRF, bir sinyal-gürültü dramatik bir artış gözlemlemiştir ve boncuk Brown difüzyon gösterilecek. Kritik açı eşit olmasaydı oluşacak tehlikeye eğik aydınlatma yerine daha optimum TIRF oluşur emin olmak için düzenli olarak (haftada ~ kez) TIRF mikroskobu ile 100 nm boncuk davranışlarını gözlemlemek için yararlı buluyorum α (bkz. Şekil 1).

G-protein kenetli reseptör agonistleri Uygulama

Astrositler Gq-reseptörler ^{6, 7} metabotropik glutamat reseptörleri ve P2Y reseptörleri (agonist, ATP, ADP) de dahil olmak üzere çeşitli ifade eder. Bu reseptörlerin aktivasyonu astrositler içinde hücre içi kalsiyum düzeylerinde önemli artışlara yol açar. Örneğin, bir hücre içi kalsiyum yükselmeler ^astrositler 8-10 ATP (30 mcM) uygulama sırasında kolayca izleyebilirsiniz . Warner Instruments switcher VC-77SP Hızlı Adım Perfüzyon Sistemi (http://www.warneronline.com/index.cfm) olarak adlandırılan hızlı bir çözüm kullanın. ~ 10 ms 'den daha az bir süre içinde bu yöntemi çözümleri uygulanabilir.

ŞEKİL 1 Karikatür ve fotoğrafları görüntüleme kurdu. A., (B) lazer montaj, kontrolörler ve kiriş kutuları bir fotoğraf gösterir iken, üzerine monte edilmiş bir airtable mikroskop bir fotoğraf gösterir. C. mikroskop aşamasında bir fotoğraf görüntüleme için monte edilen oda gösterir. Hızlı perfüzyon cihazı (step motor ve teta tüp ile birlikte) görülebilir bıraktı. Sağ tarafta bir Axopatch 200A amplifikatör headstage görülür. Karikatür set ışık yolu schematizes ve nasıl TIRF elde edilir. Lazer, kritik açı α immersiyon ortaya çıkar, böylece merkezi ayarlanır 60X 1.45 NA objektif lens ve konumunu arka odak düzlemi üzerinde duruldu. Bu noktada demiri düşük kırılma indisi orta mesafe λ (ana metin denklemi) ile toplam iç yansıma ve bozunur muzdarip. Bu durumda bu kayıt tampon astrositler ve astrositler kendilerini çevreleyen. Sonuç olarak plazma zarı ~ 100 nm içinde moleküllerin optik uyarım (ve dolayısıyla görüntüleme). Hücre içinde veya hücrenin üst yüzeyinde bu heyecanlı ise hücre karikatür, yeşil "heyecan" membran reseptörleri olarak gösterilir. TIRF mikroskopi tam bir hesap Steyer ve Almers ⁴ tarafından sağlanmıştır.

ŞEKİL 2 EPI ve TIRF mikroskobu ile elde edilen 100 nm floresan boncuk Görüntüler. A. birkaç düzine 100 nm floresan boncuk manzaralı bir alan EPI görüntüleri gösterir. Mavi ok ucu suya difüzyon. Boncuk noktası ise, cam lamel üzerine yerleşmiş boncuk kırmızı oklar noktası. B. Bu görüşe göre, sadece kırmızı oklarla gösterilen yapışık boncuk görünür A'da gösterildiği gibi aynı alan TIRF bir görüntü gösterir. Bu cam coverlsip üzerine yerleşti ve böylece ~ 100 nm kaybolan saha içinde vardı çünkü. Boncuk mavi oklarla gösterilen bu bölge içinde değildir ve TIRF görüntüleri böylece görünmez. Düşük araziler görüntülerin 3D render göstermektedir. Bu sinyal-gürültü TIRF mikroskopi tarafından gözlemlenen büyük bir artış kaybolan alanı içinde boncuklar oluşur açıktır. Aslında bu görüntüler için TIRF için 20 iken ± 0.7 EPI için sinyal-gürültü, 7.1 ± 0.6 idi.

ŞEKİL 3 EPI ve TIRF mikroskobu ile elde Fluo-4 kalsiyum gösterge boyası ile yüklü astrositler Görüntüler. Beş astrositler manzaralı bir alan A. EPI görüntüler. B. A, A ve B görüntüleri anlamlı derecede farklı olduğunu B. Not gösterilen bakış aynı alanda TIRF görüntü. Bu TIRF aydınlatma ile cam lamel yakın apozisyon sadece plazma zarı bölgelerde görüntülü çünkü. Alt panelleri göstermek ATP-uyarılmış hücre içi kalsiyum transientler EPI ve TIRF mikroskobu ile görüntülenmiş.

Tartışmalar

Astrositler hücre içi kalsiyum yükselmeler görüntüler çok iyi kurulmuştur. Bu, kendiliğinden meydana gelen nöronal aktivite veya ¹¹ astrosit yüzey reseptörleri aktive agonistleri uygulama tarafından tetiklenebilir. Bir önemli ve tartışmalı bir konu olmadığını astrosit hücre içi kalsiyum ^{yükselmeleri, nöronlar 11,} 12 reseptörleri aktive sinyal molekülleri serbest bırakılması tetikleyebilir. Yorum Haydon ^{7, 13} ve McCarthy ¹¹ laboratuvarları tarafından vurgulanan bu g?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1	Tool	VWR international	48380-068
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P0899
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane	Reagent	Sigma-Aldrich	L2020
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid	Reagent	Invitrogen	14155-063
Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red	Reagent	Invitrogen	51200-038
Penicillin-Streptomycin liquid	Reagent	Invitrogen	15140-122
Sodium pyruvate solution	Reagent	Sigma-Aldrich	S8636
HEPES solution 1 M	Reagent	Sigma-Aldrich	H0887
N-2 Supplement (100X), liquid	Reagent	Invitrogen	17502-048
Horse Serum, Heat-Inactivated	Reagent	Invitrogen	26050-088
PAPAIN-022	Reagent	Worthington Biochemical	LK003178
Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red	Reagent	Invitrogen	12348-017
B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid	Reagent	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid	Reagent	Invitrogen	25030-149
Cell Strainers	Tool	BD Biosciences	352350
BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile	Tool	BD Biosciences	353046
NaCl	Reagent	Sigma-Aldrich	S7653
KCl	Reagent	Sigma-Aldrich	P3911
CaCl2 hexahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	21108
MgCl2 hexahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	M2670
HEPES free acid	Reagent	Sigma-Aldrich	H3375
D-(+)-glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G7528
Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO	Reagent	Invitrogen	F-14217
Pluronic® F-127 20% solution in DMSO	Reagent	Invitrogen	P-3000MP
Immersion Oil TYPE DF	Microscope	Cargill Labs	16242
Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume	Tool	Warner Instruments	64-0362 (RC-21BDW)
P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater	Tool	Warner Instruments	64-0278 (P-2)
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids	Reagent	Invitrogen	F8803