Patojen İlişkili Moleküler Desen (PAMP) Triggered Tesisleri Bağışıklık (PTI) için Testi

Özet

PTI Nicotiana benthamiana bitkiler için bir hücre ölümü tabanlı test açıklanmıştır.

Özet

Çevreleri potansiyel patojen algıladıkları için, bitkiler, örüntü tanıma reseptörleri (PRRs) plazma membranlar mevcut kullanın. PRRs patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPs) olarak adlandırılan korunmuş mikrobiyal özelliklerini tanımak ve bu algılama, etkili ^olmayan patojenlerin 1,2 bitki dokularında kolonizasyonu engeller PAMP tetiklenen bağışıklık (PTI), yol açar. PTI içinde en çok çalışılan sistem FLS2-bağımlı yolak ^3. FLS2 bakteriyel flagellin bir bileşeni olan PAMP flg22 tanır.

Başarılı patojenlerin virülans faktörleri veya PTI bastırmak ve patojen hastalık ¹ neden izin etkileyiciler sahiptir. Sırayla Bazı bitkiler effektör veya efektör tetiklenen bağışıklık (ETİ) ² yol açar faaliyet tespit direnç genlerine sahip.

Oh ve Collmer ⁴ değiştirilmiş PTI için bir hücre ölümü tabanlı test açıklar. Testin N. standardize benthamiana giderek bitki-patojen etkileşimi ⁵ çalışma için bir model sistemi olarak kullanılmaktadır. PTI, bir yaprak patojen olmayan bakteri suşunun infiltrasyonu indüklenir. Yedi saat sonra, bir bakteri suşunun da hastalığa neden ya da ETİ orijinal infiltrasyon bölge örtüşen bir alana sızmış harekete geçirir. Ilk infiltrasyonu ile indüklenen PTI görünümünü ikinci bir meydan okuma infiltrasyon nedeniyle hücre ölümü geciktirmek veya önlemek mümkün. Tersine, inokülasyon örtüşen alanda hücre ölümüne görünümünü PTI bir dökümünü gösterir.

PTI ve meydan aşılar indükleyicileri dört farklı kombinasyon standardize edilmiştir (Tablo 1). Tahlil sessiz N. üzerinde test edildi benthamiana bitkiler kontrolü ve PTI geliştirmek için yeteneklerini tehlikeye gireceği tahmin edilmiştir FLS2 için susturuldu bitkiler olarak görev yaptı.

Protokol

Bölüm 1: Bitki büyüme ve bakım

Tayininde kullanılan Nicotiana benthamiana tesislerinde yaklaşık 7 haftalık olmalıdır. Onlar tüm aksiller dallar ve çiçekler kaldırmak için tahlil için en az 4-5 gün önce kesilmiş olmalıdır. Ortaya çıkar sonra bitkilerin daha kolay yönetilebilir hale getirmek için yakında aksiller dalları çıkarmak için iyi bir fikirdir.

Bölüm 2: Bakteriyel kültür

1. GÜN:

1. Plakalar ya da kültürler tayininde kullanılan tüm suşlar için aynı anda başlatılır. Pseudomonas spp. 2 indükleyicileri KBM plakalar üzerine dondurulmuş gliserol stokları (Tablo 2) uygun antibiyotik içeren ve 3 zorluk suşları, çizgi bakteri içerir. Küçük bir miktarda bakteri plakasının ortasına yayılmış olmalıdır. Plaka yaklaşık 18-24 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin. 30 Agrobacterium için yeni bir plaka, 2 ml LB sıvı kültürü başlatmak ve 250 rpm'de gecede büyümek ° C

2. GÜN:

2. Pseudomonas için, bakteriler sıvı KBM 150-200 ul ekleyin ve steril bir cam dağıtıcısı kullanılarak tüm plaka üzerinde bunları yaymak. Geri inkübatör plaka koyun ve bir 20-24 saat büyümesine izin. Iyi bir büyüme gösteren, bakteriyel bir plaka ertesi gün çim olmalıdır. Agrobacterium için, 20 mcM acetosyringone ile yaklaşık 5-10 ml LB ikincil kültür başlatmak ve 20 saat gece için 250 rpm, 30 büyümesine izin ° C.

Bölüm 3: Test için hazırlık bitkiler

2. GÜN:

1. Tahlil bir gün önce bitkiler 22-24 bir odaya taşınmış ° C olmalıdır, ~% 35-40 RH ve sabit ışık.
2. Kalın siyah bir kalem kullanarak en az 1.5 cm çapında yaprakları çevreler işaretleyin. Yaprağı başına iki ila dört çevrelerin işaretlenebilir. Çevrelerinde de aralıklı olarak ve tercihen büyük bir ven çapraz olmamalıdır. Iyi genişletilmiş yaprakları seçin. Büyük yaprakları veya dokunmatik sert veya kalın ve yaprağın alt kısımları çevrelerin işaretleme önlemek yaprakları kaçının.

İşaretleme çevrelerin bir gün önce deneme için protokol için gerekli değildir. Ancak, test olan bitkilerin çok sayıda varsa kaydeder ve daha kolay PTI indüksiyonu ve meydan aşılar arasındaki hassas zamanlama elde etmek için yapar.

Bölüm 4: PTI indüksiyonu

3. GÜN:

1. P. fluorescens ve P. 10 mM MgCl ₂ plaka hücreleri Hasat putida. Agrobacterium için, kültür hücreleri toplamak için santrifüj ve 10mM MgCl ₂ + 10 mM MES pH 5.6 tekrar süspansiyon haline getirin. MgCl _2-MES çözümü santrifüj ve tekrar süspansiyon tekrarlayın. 600 nM hücreleri optik yoğunluk (OD) ölçün. ODS nihai gerekli değerleri Tablo 2'de açıklandığı gibi. Pseudomonas sonunda 10 mM MgCl ₂ ve Agrobacterium yeniden süspanse edilmelidir MgCl _2-MES çözümü ayarlayın. 25 ml toplam hacmi yaklaşık 40-50 noktalar aşılamak için yeterli.
2. PTI indükleyicileri 1 ml iğnesiz şırınga kullanılarak yaprakları üzerinde önceden işaretlenmiş çevrelerin içine sızmak. Bitkiler infiltre edildiği düzeni ve infiltrasyon başladı tam zamanı yazınız.

Bölüm 5: Mücadelesi aşılama

1. P. hazırlayın syringae pv. domates DC3000, 4.1 ve Tablo 2'de açıklandığı gibi meydan Pst DC3000 Δ hopQ1-1 ve Ps pv. tabaci.
2. Indüksiyon yapıldı indükleyicisi infiltrasyon Yedi saat sonra meydan infiltrasyon, bitkilerin aynı sırayla gerçekleştirin. Genellikle, ilk aşılama dairenin çevre üzerinde bir nokta, ikinci aşılama dairenin merkezi olarak kullanılabilir. Bir yaprak üzerinde birden fazla lekeler varsa o sızıntıların çakışmadığından emin olun.
3. Tam CFU sayısını belirlemek için uygun antibiyotik içeren KBM veya LB plakalar üzerinde tayininde kullanılan tüm kültürlerin Plaka seri dilüsyonları.

Bölüm 6: PTI parçalanması için Puanlama

5. Gün:

1. Pst DC3000 ile itiraz edilen noktalar hücre ölümü nedeniyle ETİ görünüm için bakın. Infiltrasyon örtüşen alanı içinde hücre ölümü PTI bir dökümünü gösterir ve olumlu bir fenotip olarak atılır.

7. Gün:

2. Pst DC3000 Δ hopQ1-1 veya Ps pv ile itiraz edilen noktalar hücre ölümü nedeniyle hastalığa görünüm için bakın. Tabaci . Puan bölüm 6.1 'de açıklandığı gibi, aynı şekilde olumlu bir fenotip.

Kontrol bitkiler (PTI için tehlikeye olmamalı) infiltrasyon örtüşen alanda hücre ölümüne göstermeye başladığınızda, başka gözlemler yapmayı durdurmak.

Bölüm 7: Temsilci sonuçları

Şekil 1 P. bir test sonucunu gösterir fluorescens meydan okuma olarak indükleyicisi ve Pst DC3000 olarak kullanılmıştır.

Şekil 1 P. fluorescens N. üzerine sızmış benthamiana yaprakları (siyah daire) PTI ikna etmek için ve 7 saat sonra, spot Pst DC3000 (beyaz daire) ile meydan. FLS2 için susturuldu Tesisleri P. bölgede PTI bir dökümünü gösterdi fluorescens hücre ölümü görüldüğü gibi, (A) infiltre edildi. Kontrol bitkiler susturulması değil, PTI (B) indüksiyon nedeniyle örtüşen alanda hiçbir hücre ölümü gösterdi. Kırmızı oklar eksikliği veya infiltrasyon örtüşen alanda hücre ölümüne varlığı göstermektedir. Fotoğraflar, infiltrasyonların 2 gün sonra alındı. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .

PTI indükleyicisi	Hücre ölüm eliciting meydan okuma	Doğa hücre ölümü	Kod
Pseudomonas fluorescens 55	Pseudomonas syringae pv domates (Pst.) DC3000 6	ETİ	/ Pf DC
P. putida KT2440	Pst DC3000	ETİ	Pp / DC
P. fluorescens 55	Pst DC3000 Δ hopQ1-1 6	Hastalık	Pf/Q1-1
Agrobacterium tumefaciens GV2260	P. syringae pv. tabaci 11528R	Hastalık	Agro / Ptab

Tablo 1: PTI uyaran ve hücre kombinasyonları ölüm eliciting PTI için hücre ölümü tayininde kullanılır mikropların.

Bakteri suşu	Seçim orta	Final OD deneyde kullanılan	Sorumlu CFU / ml
P. fluorescens 55	KBM ampisilin (100 ug / ml)	0,5	1 x 10 9
P. putida KT2440	KBM ampisilin (100 ug / ml)	0,5	1 x 10 8
A. tumefaciens GV2260	LB Rifampisin (100 ug / ml)	0,5	5 x 10 8
Pst DC3000	KBM Rifampisin (100 ug / ml)	0,02	2 x 10 7
Pst DC3000 Δ hopQ1-1	KBM Rifampisin (100 ug / ml)	0.1 100 kat seyreltme	1 x 10 6
P. syringae pv. tabaci 11528R	KBM Rifampisin (100 ug / ml)	0.1 100 kat seyreltme	1 x 10 6

Tablo 2: Kültür ve inokulum seviyeleri tayininde kullanılır. OD ve ilgili CFU seviyeleri spektrofotometreler farklı marka arasında değişebilir.

Tartışmalar

Hücre ölümü tabanlı test PTI bir gen katılımı belirlemek için kullanılır. Örneğin, bir gen ilgi kaybı fonksiyon-mutantlar Bu testte kullanılarak test edilebilir. Indükleyicisi ve Tablo 1'de verilen mücadele aşılar 4 kombinasyonları Out, sadece tek bir kombinasyonu bitki arka planda bir fenotip neden olabilir mümkündür. Biz FLS2 susturulması için bitkiler Pf / DC ve indükleyicisi ve meydan aşılar (Tablo 1) Pf/Q1-1 kombinasyonları PTI bir dökümünü gösterir olduğunu gözlemledik.

Bu testi için çevre koşulları, Bölüm 3.1 'de açıklanan olanlar mümkün olduğu kadar yakın olduğunu esastır. Düşük nem puan tahlil zorlaştırır, çok hızlı devam etmek için hücre ölümüne neden olur. Protokolde belirtilen şartlar laboratuarında işe yaramazsa, daha sonra indükleyicisi veya meydan aşılama düzeyini değiştirerek deneyin. Değiştirilmiş olabilir başka bir parametre daha kısa zaman aralıkları tahlil kontrolü bitkiler çok hızlı bir şekilde yıkmak için neden olduğu bulundu olmasına rağmen, gidiş ve meydan arasındaki zaman aralığı.

Biz en az 4-5 bitkiler bir deneyde test edilmesi ve olumlu bir fenotip en az 3-4 bağımsız deneyler tekrar edilmesi önerilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES	Fisher Scientific	BP300-100	Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature.
Life Science UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter Inc.	DU 730