Zebra balığı Oligonükleotid Mikroarray Platformu kullanarak Global Gen İfadesi Analizi

Özet

Gen mikroarray'ler genom düzeyinde gen ekspresyonu güçlü araçlardır. Bu teknoloji, gelişim biyolojisi ve toksikoloji de dahil olmak üzere biyolojik disiplinlerin çeşitli uygulaması vardır. Bu video zebrafish için kapsamlı bir oligonükleotid mikroarray platformunu kullanarak küresel gen ekspresyon analizi için detaylı bir protokoldür.

Özet

Roarray teknolojisi genom bazında transkript seviyeleri kantitatif ölçüm ve gen ekspresyon profil izin verir. Roarray teknolojisi uygulamaları gelişimsel aşaması ile ilgili olarak küresel bir hastalık durumu gen ekspresyon analizi de dahil olmak üzere çeşitli pek çok biyolojik disiplinlerde kullanılan ve zehirli yanıtlarında. Burada, küresel gen ekspresyon analizi kapsamlı bir zebrafish özel oligonükleotid mikroarray platformu kullanarak bir göstergesi sayılabilir. Zebrafish ifade mikroarray platformu hedef yüzde 12 problar kadar 37.157 hedefleri sorguya 385.000 probları, uzunluğu 60 baz çifti içerir. Bu platform için, Zebra balığı kullanılabilir tüm cDNA ve genomik bilgiler Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (dahil olmak üzere çeşitli genomik veritabanlarından toplanmıştır. http://genome.ucsc.edu) ve ZFIN (http://www.zfin.org). Sonuç olarak bu ifadeyi dizi güncel zebrafish transcriptome tam kapsama alanı sağlar. Zebrafish ifade mikroarray Roche NimbleGen (Madison, WI) tarafından basılmıştır. Bu teknik bir gösteri floresan cDNA bir ürün etiketleme, etiketli cDNA ürün mikroarray platformu hibridizasyon, ve tek renk analizi strateji kullanarak sinyal alımı için dizi tarama içerir.

Protokol

Bölüm 1: cDNA Floresan Etiketleme

Cy3 boya mikroarray deneyde kullanılan fotoğraf bozulmaya karşı hassas. Bu prosedür, bir ışık az miktarda yer almalıdır. Etiketleme protokol BioPrime Array CGH Genomik Etiketleme Sistemi Kılavuzu ¹ uyarlanmıştır.

1. Etiketleme reaksiyon için reaktifler -20 ° C'de saklanır. BioPrime Array CGH Genomik Etiketleme Sistemi çözülme 2.5X Rastgele Primer Buffer, 10X dCTP karışımı, ve nukleaz ücretsiz su. Ayrıca Cy3 dCTP boya Çözülme. Çözündükten sonra, kısa bir süre kullanmadan önce tüm reaktifler santrifüj.
2. Ayrı bir etiketleme reaksiyonu analiz edilecek her cDNA bir örnek için tamamlanması gerekecektir. 0,6 ml kalın duvarlı bir tüp içine 86 ul toplam hacmi elde etmek için cDNA 500 ng, 40 ul 2.5X Rastgele Primer Tampon ve nukleaz ücretsiz su ekleyin.
3. İyice karıştırın ve kısaca santrifüj. 5 dakika reaksiyon 100 ° C bir termalcycler inkübe edin.
4. Derhal reaksiyon 10 dakika buz banyosunda bulamaç haline transferi.
5. Her bir tüp sonra 10 ul 10X dCTP karışımı, 2 ul 1 mM Cy3-dCTP ve 2 ul Exo Klenow DNA polimeraz ekleyin. Exo Klenow DNA polimeraz dondurucuda sol ihtiyaç kadar olmalı ve her zaman buz üzerinde tutulmalıdır.
6. Iyi reaksiyon karışımı ve kısa süreli santrifüj.
7. 37 ° C'de 16 saat bir PCR reaksiyonu inkübe edin.

Bölüm 2: Etiketli cDNA Yağış

1. NimbleGen Hibridizasyon Sistemi protokol sırayla devam eden ve önce 42 ° C'ye kadar sistem dengeye izin
2. Her reaksiyon için Microcon sütun, 1.5 ml tüp içine yerleştirin. 300 ul 0.1x SSC etiketleme reaksiyonu (100 ul) içeriğini her sütun ekleyin.
3. 4 10 dakika 16,100 xg'de sütun içeren tüp ° C Santrifüj
4. Hafif pembe renkli olması ve başka bir 300 ul 0.1x SSC, sütun ekleyebilirsiniz yoluyla akışı, atın.
5. 16,100 xg'de 10 dakika santrifüj tekrarlayın 4 ° C
6. Üzerinden akış atın ve ek bir 300 ul 0.1x SSC sütun ekleyin.
7. 12 dakika için 16,100 xg'de santrifüjleyin 4 ° C
8. Akış atın. Yoluyla akışı bu son yıkamadan sonra açık olmalıdır ve sütun pembe etiketli cDNA görmek mümkün olmalıdır.
9. Sütununda 100 ul nükleaz içermeyen su uygulayın. 1.5 ml tüp sütunu kaldırmak ve yeni bir 1.5 ml tüp içine sütun ters.
10. 2 dakika boyunca 2.300 xg'de santrifüjleyin 4 ° C Etiketli cDNA, tüpün alt kısmındaki toplar su rehidrate edilmelidir.
11. DNA konsantrasyonunun hesaplanması ve nükleotid Cy3 oranı 23,15 ile çarpılır A ₂₆₀ / A ₅₅₀ oranı eşittir oranı boya baz hesaplanırken boya dahil değerlendirmek için, üreticinin talimatlarına göre bir NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanın . Boya oranı baz 50 ve 80 arasında olmalıdır.
12. CDNA yeterince etiketli Eğer, kısım 6 mikrogram yeni bir 1.5 ml tüp içine cDNA etiketli.
13. 3 M NaOAc pH 5.2, 0.1x hacmi ve izopropanole 1X hacmi karıştırın. Karışım, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe izin verin.
14. Sonraki oda sıcaklığında 20 dakika 16,100 xg'de örnek santrifüj.
15. Pembe renk olmalıdır DNA pelet, bozmadan süpernatantı dikkatle atın.
16. 500 ul% 70 EtOH ve hafifçe çevirerek karıştırın ekleyerek bir etanol yıkama yapın.
17. Oda sıcaklığında 5 dakika 16,100 xg'de örnek santrifüjleyin.
18. Tüp, invert süpernatantı ve pelet 5 dakika kurumasını bekleyin. Bu aşamada pelet -20 saklanabilir ° C istenen veya protokol hibridizasyon adıma devam edilebilir.

Bölüm 3: Hibridizasyon

Gen İfadesi Analizi ² Roche NimbleGen Diziler Kullanım Kılavuzu hibridizasyon işlemi uyarlanmıştır.

1. 5 ul nükleaz ücretsiz su pelet çözülür.
2. Sonra pelet Tablo 1'de yer alan hibridizasyon bileşenleri eklemek çözülür. Hibridizasyon bileşenleri Roche NimbleGen Hibridizasyon Kiti. Tüm bileşenleri eklendikten sonra toplam hacmi 18 ul toplam gerekir. İyice karıştırın ve kısaca altta içeriğini toplamak için tüp spin.
3. Bir sonraki adım, 5 dakika boyunca 95 ° C'de ısı bloğu üzerine yerleştirerek etiketli cDNA doğasını.
4. Diziler aşağıdaki adımları hazırlanan NimbleGen Hibridizasyon Sistemi hemen tüp transferi.
5. Mikroarray'ler her zaman dikkatli ve üreticinin talimatlarına göre muhafaza edilmelidir. Roche NimbleGen karanlıkta, oda sıcaklığında kurutucu ile ifade dizileri depolamak önerir.
6. NimbleGen dizi işleme aksesuarları Hassas Mikser Hizalama Aracı (PMAT) dizi yükleyin.
7. PMAT üzerine X1 mikser Yük ve forseps ile yapışkan şeridi çıkarın. PMAT güvenli bir şekilde kapatın. PMAT delikten miksere basınç uygulayın ve yavaş yavaş, dizi ve karıştırıcı PMAT boşa bu kadar açık.
8. Sıkıca diziye sızdırmazlık sağlamak için mikser dışında çevresinde brayer basınç uygulayın tamamlandıktan ve varsa kabarcıkları giderin. Sıcak dizi mikser karmaşık melezleme sistemi üzerine yerleştirin.
9. Bir pipeti kullanarak, yavaş yavaş dolgu portuna etiketli örnek 15 ul ekleyin. Bu mikser merkezinde bulunan delik. Pipet örnek herhangi bir hava kabarcığı olmadan karıştırıcı ile eşit şekilde yayılır, böylece yavaş ve sabit bir basınç uygulayın. Liman deliklerden herhangi bir aşırı örnek silin ve yapışkanlı şeritler ile bağlantı noktası delik mühür.
10. Mandalı kapatın ve B NimbleGen Hibridizasyon Sistemi program kullanarak hibridizasyon çözüm karıştırma başlayın. Mikroarray'ler 16-20 saat melezleşme izin verin.

Bölüm 4: Post-hibridizasyon yıkar ve Mikroarray taranması

Gen İfadesi Analizi ² Roche NimbleGen Diziler Kullanım Kılavuzu yıkama ve tarama yönteminin uyarlanmıştır.

1. Hibridizasyon Tablo 2'de belirtildiği gibi yıkama tamponlar hazırlamak tamamlanması yakındır. 42 Pre-sıcak Yıkama Tampon IA ° C su banyosu.
2. GenePix 4000B dizi tarayıcı açın ve tarayıcı kullanmadan önce yaklaşık 15 dakika için ısıtın.
3. Önceden ısıtılmış Yıkama Tampon IA bir çanak içine dökün.
4. Jig (NimbleGen dizi işleme aksesuarları ürünle verilir) NimbleGen Hibridizasyon sistemi ve slayt dizi mikser kompleksi çıkarın. Batmak montaj ve önceden ısıtılmış Yıkama Tamponu IA içine dikkatlice kaydırarak soyma mikser kaldırmak.
5. Yıkama Tamponu IA 15 saniye jig ve ajitasyon dizi çıkarın.
6. Hızla, oda sıcaklığında Yıkama Tampon IB bir slayt rafa dizi transfer. Slayt raf 2 dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın.
7. Yıkama Tamponu II içine slayt raf transferi ve 1 dakika boyunca ajitasyon.
8. 15 saniye yıkayın Tampon III ve ajitasyon içine slayt raf transfer.
9. Dizi santrifüj kurutma slayt içine aktarın ve tüm nemi çıkarmak için 2 dakika boyunca döndürün. Tarama geçin.
10. Bu boya, ışık ve ozon hem de duyarlı olduğundan hemen dizi tarama önerilir.
11. GenePix 4000B dizi tarayıcıya dizi, barkod, aşağı yükleyin.
12. GenePix Pro yazılımı açın ve dizi tarama geçin. Roche NimbleGen gen ekspresyonu dizileri bir renk hibridizasyon strateji kullanmaktadır. Sonuç olarak sadece tek bir dalga boyu tarama için gereklidir. 532 nm lazer kullanarak Cy3 floresan sinyal tarayın. Donanım ayarı iletişim kutusunu açın ve değeri 500 - 532 nm lazer DEVRESEL_ÖDEME değerini ayarlayın.
13. Donanım ayarı iletişim kutusunda,% 100, ortalama 1 ila 5 mikron piksel boyutu, hatları, güç ve 0 mikron konumda odak.
14. Bir önizleme tarama yapın ve tarama alanını ayarlayabilirsiniz.
15. Taraması gerçekleştirin.
16. Bir kere tarama görüntü histogramı kontrol tamamlandı. İdeal 1e-5 normalize sayar özellikleri ~% 1-2 doymuş olduğu 65.000 doygunluk sınırı anlamı olmalıdır. Normalize sayar 1e-5'ten az ise, PMT kazanç ve rescan slayt artar. Normalize sayımları 1e-5'ten büyük ise, PMT kazanç ve rescan slayt azalır.
17. Bir kere tarama görüntüyü kaydetmek tamamlandı. Bu görüntüler için referans kolaylığı için standart bir adlandırma kuralı seçmek için tavsiye edilir. Görüntü veri normalleştirme ve yoğunluk değerlerinin hesaplanması için tercih veri analiz programı yüklenebilir.

Temsilcisi Sonuçlar

Önce 0.1x SSC ile yıkar başlayan cDNA Cy3 floresan etiketleme reaksiyon verimliliğini değerlendirmek için başlayabilir. Sonraki her yıkama sırasında üzerinden akış yoluyla geçen akışı ile açık renk daha az pembe haline gelmelidir. Buna ek olarak, bu yıkama adımları sırasında Cy3 etiketli cDNA ürün sütun üzerinde görünür olmalıdır. Üzerinden akış rengi parlak pembe veya sütununda herhangi bir pembe ürün varsa, bu etiketleme tepki doğru devam etmediği iyi bir göstergedir. Etiketleme reaksiyon nicel etiketli DNA ve baz boya oranı (Şekil 1) konsantrasyonunu belirlemek için NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanılarak değerlendirilebilir. Etiketleme tepki rutin laboratuvarda en az 10 mg işaretli DNA elde edilir. Boya dahil, Cy3 oranı nükleotid 23,15 ile çarpılır _A 260 / _A 550 oranı eşittir basit bir temel / boya oranı ile hesaplanır . 50-80 gelen değişen değerler etiketleme reaksiyon yeterli boya dahil göstermektedir. Etiketleme reaksiyon mikrofon üzerine, DNA veya kötü boya dahil, örnek hibridizasyon bir düşük konsantrasyonda verimleriroarray tavsiye edilmez ve etiketleme reaksiyon tekrar edilmelidir.

Görüntü histogramı ve mikroarray taranan görüntü (Şekil 2) değerlendirerek hibridizasyon kalitesinin değerlendirilmesi yapılabilir. Kabul edilebilir döllemeler doymuş özellikleri% 1-2 (yani, verimli 1e-5 65.000 doygunluk sınırını normalize sayar) PMT değeri 500 yakındır. PMT değeri 1e-5 normalize sayıları 65.000 doygunluk sınırını elde etmek için 500 büyük ölçüde ayarlanabilir varsa, bu genellikle kötü mikroarray etiketli cDNA hibridizasyon gösterir. Veri kalitesi, veri sonraki analizi ile devam eder oluşacaktır. Hibridizasyon kalitesi de niteliksel olarak taranan bir dizi (Şekil 3) görüntüleri izlemek tespit edilebilir. Roche NimbleGen Hibridizasyon Kiti bir hizalama oligo karışımı Cy3 ve diziler üzerinde hizalama özellikleri melezleşme Cy5 etiketli 48mer oligonükleotidler içerir. Hizalama oligos yoğunluğu dizinin diğer özellikleri kalitatif değerlendirme dizinin üzerine floresan etiketli cDNA hibridizasyon verimliliği üzerinde bir kalite kontrol izin verir. Yapılan incelemelerden sonra, bir scatter plot analiz veri gen ekspresyonu göreli düzeylerini belirlemek ve farklı örnekleri (Şekil 4) arasında ifade edilir genleri tanımlamak için kullanılabilir.

Şekil 1. CDNA Cy3 ile etiketlenir. Etiketli cDNA verim ve boya dahil NanoDrop spektrum NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanılarak değerlendirilebilir. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .

Şekil 2. Hibridizasyon mikroarray tarama Kalite için GenePix histogram görüntü histogramı değerlendirerek tespit edilebilir. Kabul edilebilir döllemeler özellikleri 1e-5 normalize sayıları ile 500 yakın PMT değeri 65.000 doygunluk sınırı doymuş% 1-2 olacaktır. Lütfen Şekil 2'de büyük halini görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3. Taranmış mikroarray görüntü Hibridizasyon kalite mikroarray taranan görüntüyü görüntülerken tespit edilebilir. Görüntü özelliği floresan doğru hesaplama önlenmesi, böylece toz veya diğer engel faktörler her özellik görselleştirme yasaklayan varlığı için incelenir ve olmalıdır. Hizalama oligos yoğunluğu hibridizasyon verimliliğini değerlendirmek için dizi diğer özellikleri mukayese edilebilir.

Şekil 4. Bir analiz mikroarray deney scatter plot Bu prosedürün amacı farklı örneklerinde ifade genleri tanımlamak için. Mikroarray verileri daha detaylı analiz ve farklı ifade genleri görselleştirmek için bir scatter plot görülebilir.

Tablo 1 Roche NimbleGen Hibridizasyon Kiti Bileşenleri hibridizasyon adım 2 eklemek için.

Bileşen	Hacim
Örnek (suda çözünen)	5 ul
2X Hibridizasyon Arabelleği	9 ul
HYB A	3.6 ul
Hizalama Oligo	0.4 ul
Toplam hacim	18 ul

(Tablo 2). Hibridizasyon Aşağıdaki diziler, yıkama için hazır olmak tamponlar yıkayın.

Bileşen	Yıkama Tamponu IA *	Tampon IB yıkayın	Yıkama Tamponu II	Yıkama Tamponu III
Su	225 ml	225 ml	225 ml	225 ml
10X Yıkama Tampon I, II ve III	25 ml	25 ml	25 ml	25 ml
1 M DTT	25 ul	25 ul	25 ul	25 ul
Toplam hacim	250 ml	250 ml	250 ml	250 ml

42 * Ön-sıcak ° C

Tartışmalar

Burada ayrıntılı dahil olmak üzere birçok mikroarray protokolleri, hibridizasyon ölçme ve nicel bir araç olarak floresan boya kullanın. Cy3 floresan boya, fotoğraf ve ozon bozulması duyarlı. Bu prosedür minimal aydınlatma yapılan olması tavsiye edilir. Buna ek olarak, küçük toz parçacıkları hibridizasyon ve tarama engelleyebilir. Çalışma alanını temiz ve tozdan arındırılmış emin olmak için özel dikkat verilmelidir.

Bu prosedürde açıklanan etiketleme proto...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Array Microcentrifuge Dryer	ISC Bioexpress	C-1303-T
BioPrime Array CGH Genomic Labeling System	Invitrogen	18095-011
Cyanine 3-dCTP	PerkinElmer, Inc.	NEL576
GenePix 4000B	Molecular Devices	GENEPIX 4000B
Microcon YM-30	EMD Millipore	42411
NimbleGen Array Processing Accessories	Roche Group	5223539001
NimbleGen Hybridization Kit	Roche Group	5223474001
NimbleGen Hybridization System 4	Roche Group	5223652001
NimbleGen Wash Buffer Kit	Roche Group	5223504001
X1 Mixers	Roche Group	5223725001