Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

Özet

Cryolysis, üre solubilziation, HILIC fraksiyonasyon ve fosforile peptidlerin IMAC zenginleştirme kullanarak kantitatif fosforilasyon prosedürü açıklaması.

Özet

Bu protokol isotopically ağır ve hafif S. cerevisiae hücrelerinin yağ asidi oleat, büyüme ve stimülasyon açıklar. Hücreler bir bilyalı değirmen değirmeni ve üre çözünürleştirme çözüm getirilen grindate cryolysis prosedür kullanılarak öğütülür. Bu prosedür, fosforilasyon korunması ve hücre parçalama sırasında phosphoproteome reorientation önlenmesi, metabolik olarak inaktif bir devlet hücreleri lizis sağlar. Azaltma, alkilleme tripsin, proteinlerin sindirimi takiben, örnekleri C18 sütun ve fraksiyonasyon hidrofilik etkileşim kromatografi (HILIC) kullanılarak azaltılabilir örnek karmaşıklığı desalted. HILIC sütun tercihen phosphoproteomics için de uygundur hidrofilik molekülleri korur. Fosforile peptidler kromatografik profili olmayan fosforile muadillerine göre daha sonra Zehir eğilimindedir. Fraksiyonasyon sonra, phosphopeptides phosphopeptide zenginleştirme için ücret tabanlı yakınlık dayanmaktadır immobilize metal kromatografi kullanılarak zenginleştirilmiştir. Bu prosedürün sonunda örneklerin kantitatif kütle spektrometresi ile analiz edilmesi için hazırız.

Protokol

Hücre büyümesi ve medya

1. 1.0 minimal bir maya orta iki (Amonyum Sülfat veya amino asitler olmaksızın% 0.17 Maya Azot Bankası,% 0.5 'lik Amonyum sülfat) 1 litre kültürü içine sonra tohum OD ₆₀₀ 100 mL zengin medya geceleme BY4742Δarg4Δlys1 hücreleri tek bir koloni içeren bir (Isotec ¹³ C ₆ ¹⁵ N ₄₎ ve lisin ⁽¹³ C ₆ ¹⁵ N _2; Isotec) 20 mg / L isotopically normal veya ağır arginin ile desteklenmiş amino asitler, tam.
2. Hücreler 1,8 OD _600, 18 saat boyunca yetiştirilmiştir. Etiketli izotopların tam birleşme hücreleri elde etmek için en az 9 nesiller geçmesi kritik öneme sahiptir. Işık örnek, orta (isotopically Normal arginin ve lizin,% 0.2 oleat (Sigma Kimyasallar) ve% 0.5 Tween 40 (Sigma Kimyasallar)) içeren bir oleat içine reseeded ve başka bir 85 dakika için uyarılan, steril su ile yıkanır, pelet. Bu arginin ve lizin açısından bir isotopically ışık verimleri, örnek ve isotopically ağır bir glikoz yetişen referans örnek oleat uyarılır.

Hücre Lizis, İzolasyon ve Peptitler, Fraksiyonu

3. Santrifüj şişesi tartılır. 3 dakika boyunca santrifüj Hasat örnekleri. Medya çıkarın ve aşırı sıvı aspire. Pelet ve şişe (genellikle 1-2 gram arasında verim) sıvı nitrojen sonra flaş dondurma tartılır. 'Taşlama' tampon pelet ağırlığı, sıvı azot (Fosfat% 10 gliserol, Proteaz İnhibitörleri (SigmaFAST Proteaz İnhibitör Tablet, Sigma, (PBS, Gibco) Tuzlu Tamponlanmış) dondurulmuş pelet hacmi eşdeğer ekleyin ve Fosfataz inhibitörleri (Thermo Scientific HALT )).
4. Taşlama damar sıvı nitrojen içinde dondurun. Sıvı azot kaynama geçene kadar bekleyin. Dondurulmuş bilyeli rulmanlar, taşlama gemi pelet aktarın.
5. 600 rpm'de 3 dakika için bir yön ters ile 1 dk 20 sn döngüsü ile Grind. Sıvı nitrojen içinde taşlama gemi dondurursam. Toplam öğütme süresi 15 dakika 4 kez daha tekrarlayın.
6. 50ml Falcon tüp yeri kuru buz içine donmuş grindate toplayın. Kullanmak üzere saklayın -80 ° C ye kadar hazır.
7. 8M üre, 0.1M amonyum bikarbonat, 0.1M Tris pH: 8.6 10ml çözüm olun. Üre tampon 3 cilt donmuş grindate 1 hacim (örneğin üre tampon 3mls için 1 ml PBS ile 1 gram pelet) ekleyin. Hemen bir prob ucu sonikatör (10 saniye bakliyat 2) ile karışım sonikasyon. Ucu çözüm köpük önlemek için tüpün alt kısmına yakın tutun. Grindate hemen çözüm gitmek gerekir.
8. 4 5 dakika santrifüj lizat temizleyin ° C
9. Supernatant taze tüplerine transfer.
10. 0,5 M Tris yeni bir kısım olun [2-carboxyethyl] fosfin (TCEP). 5mM bir final konsantrasyon için 1:100 örnek ekleyin. 37 ° C'de 1 saat
11. Azaltılmış cysteines Alkilasyon. Oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. 1M iodoacetamide taze bir kısım olun. (Tüp folyo ile sarın) karanlıkta tutun. 20mm bir final konsantrasyon ekle. Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
12. 1 saat boyunca oda sıcaklığında 1M stok 20mm DTT iodoacetamide Quench
13. Protein standart Bradford veya BCA assay (tarif) ile sayısal olarak. Aşağıdaki SDS PAGE ile analiz için bir örnek ele alalım.
14. Ağır izotoplar dahil doğrulamak için, azaltılmış ve alkillenmiş lizat 100 ul kullanın. DH ₂ O ile 01:04 sulandırınız sonikasyon ve tripsin için 50:1 protein tripsin eklemek. C18 Ultramicrospin sütunlar (The Nest Grubu) ile elektrikli süpürge ve sonra desalt hız aşağı en az 4 saat, kuru örnek Digest.
    1. 100 ul Asetonitril Hidrat sütun
    2. 200 ul% 0.1 TFA ile dengelenmesi.
    3. 200 ul% 0.1 TFA kuru örnek tekrar Sütun üzerine yükleyin. ~ 200 xg veya sütun akışı için gerekli minimum hız santrifüjleyin.
    4. 200 ul% 0.1 TFA ile iki kez yıkayın.
    5. 50 ul Asetonitril% 60,% 0.1 TFA ile iki kez ile Zehir.
    6. Vac hız Kuru örnek.
    7. 20 ul% 0.1 formik asit süspanse edin örnek. Bir kütle spektrometresi 2 ul çalıştırın. Isotopically ağır arginin ve ilgili m / z spektrumları 10 ve 8 Dalton vardiya tarafından lizin dahil kontrol edin. % 98 - 96 arasında her amino asit için birleşme olmalıdır.
15. Isotopically ağır ve hafif örneklerin eşdeğer miktarda (protein mg) karıştırın.
16. % 20 metanol ile örnek 01:04 sulandırınız.
17. 1:200 az tripsin ekleyin. 37 o gece inkübe ° C
18. SDS SAYFA sindirim tamamlanması için gitti. 2 ve 4 predigestion örnek ul ve 8 çalıştırınd 16 ul sonrası tripsin sindirmek. Coomassie boyama sindirim eksiksiz olduğunu gözünüzde canlandırın. Tam değilse, bir prob ucu sonikatör kısaca örnek sonikasyon ve tripsin ile sindiremez.
19. Vac hız örnek kurulayın. Kuru pelet çözüm girer kadar süzülmüş dH ₂ O ve vorteks 200 ul eklediğinizde. Vac bir hızda aşağı Kuru örnek. DH ₂ O ile yeniden süspanse edin Örnek yeniden kurulayın.
20. % 0.1 Trifluoracetic Asit yeniden süspanse pelet (TFA, Sigma). PH pH şeritleri kullanarak 3 civarında olduğunu kontrol edin. % 10 TFA ile asitlenir Gerekirse.
21. Pelet dışında herhangi bir çökelti.
22. Waters Sep-Pak Vac 500 mg C18 kolon örnekleri Desalt. Bu sütunlar aşırı yüklenmeyin. Maksimum miktarı 5 mg ama biraz daha az yük bulunuyor. Örnek gerekirse birden çok sütun arasında Böl.
    1. 5 ml% 100 asetonitril Hidrat sütun. ~ 200 xg veya sütun akışı için gerekli minimum hız santrifüjleyin.
    2. 5ml% 0.1 TFA ile sütun dengelenmesi. Örnek Yük. Akışını toplamak ve yeniden yükleyin.
    3. 5 ml% 0.1 TFA ile yıkayınız. Tekrarlayın.
    4. Zehir 2ml 60% Asetonitril,% 0.1 TFA.
    5. Vac bir hızda aşağı Kuru örnek.

Phosphopeptides Peptid Fraksiyonu ve İzolasyon

1. Peptitler HILIC bir sütun üzerinde fraksiyone. Biz Tosoh TSK-Gel Amid-80 4.6 mm x 25 cm bir bekçi sütun ile analitik kolon. Kullanın Bu adım için zaman ayırın, sonra çalıştırmak iki boş gradyanlar numunenin yüklemeden önce% 90 az 2 saat sütun çalıştırmak. XX etrafında bu boyutu olduğu düşünülen bir sütun üzerinde maksimum yük, genellikle başına en fazla 5 mg vadede yük yoktur.
2. Solvent A -% 98 ACN/0.1% TFA
   Solvent B -% 2 ACN/0.1% TFA
   % 90 yük üzerinde 20 ',% 90,% 85 üzerinden 5,% 85% 60 A üzerinden 40,% 60% 0 5 üzerinden'% 0,% 90 A üzerinde 5 '.
3. Akış hızı 1ml/min ve fraksiyonları% 85% 60 A degrade başlayarak 2 dakika aralıklarla toplanmıştır.
4. 10 kesirler sayısını azaltmak için kesirler birleştirin. Artan kesirler muhtemelen phosphoproteome daha fazla kapsama alanı verecektir.

Phosphopeptides, zenginleştirilmesi

1. Phosphopeptides PHOS seçin Demir Affinity Jel ile zenginleştirilmiştir. Biz kısım tekrarlanır dondurulmasından kaçınmak için elimizden IMAC reçine. 50 ml 250 mM asetik asit,% 30 ACN yük çözümü olun. HCl ile pH 2.7 'ye getirin. 500 ul yük çözüm pelet tekrar HCl veya NaOH ile ayarlamak gerekli olduğu, pH kontrol edin.
2. Ön yıkama 200 uygun bir sütun IMAC boncuk ul. Biz Molbiotec dönüş sütunları kullanın.
   Her fraksiyonu% 50 bulamaç (jel çözüm yüklemek için) 15 ul ekleyin ve sonunda dönme üzerinde son 30 örnekleri 'kuluçkaya yatmaktadır. Analizi için akış tutun.
3. Yük çözüm örnekleri 3 kere yıkayın ve 500 kez ile ul süzülmüş dH ₂ O
4. 2 Zehir peptidler - 400 50 mM Na ₂ HPO ₄ (pH 8.4) tampon ul ile 3 dk. Bir cam flakon aktarın.
5. Ile pH 3 ila 5 ul% 100 Formik asit, sıvı azot flaş dondurma ve hız vac kurutulmuş numune aşağı asitlenir.
6. % 0.1 TFA ve yukarıda açıklandığı gibi temiz C18 200 ul süspanse edin phosphopeptides. Vac hız yıkandı, örnekleri kurulayın.
7. % 0.1 formik asit 20 ul peptitler tekrar 2 kütle spektrometresi analizleri başına ul ya da gerektiği gibi kullanın.

Notlar

Bu protokol için 'kör' bir çalışma olacak. Hücre parçalama batı blot ve Bradford ve BCA deneyleri ve tripsin sindirim da kolaylıkla tespit edilebilir, izlenebilir. HILIC sütun bu benzer bir iz verdi, ya da diğerleri [1, 2] bağlı olarak kullanılan likit kromatografi makine tarafından görülebilir. Örnekler kütle spektrometresi tarafından izlenmekte; ucuz makineleri gibi yüksek bir kitle doğruluğu, yüksek çözünürlüklü makine yüksek maliyet analizleri gitmeden önce LCQs veya MALDIs gibi örnekleri test edin. Bir asit ile bir örnek kurutma Son olarak, cam kullanın.

Tartışmalar

Bu yöntem, kantitatif analiz edilebilir phosphopeptides bir zenginlik verecektir. Parametrelerin sayısı bu protokolde değişiklik, ama hatırlanması gereken en önemli yönü, fosforilasyon korumak için olabilir. Eğer böyle ICAT gibi in vivo, etiketleri hücrelerin etiket değil. Eğer örneğin ölçümü için hücrelerin hazırlanması çok sayıda farklı şekillerde elde olması. [3 veya ITRAC [4] farklı ölçümü için iki kültürler etiketlemek için yazılan çıkarma kullanılır olması. et...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4	Sigma-Aldrich	608033
Isotec™ L-Lysine-15N2	Sigma-Aldrich	609021
GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid	Invitrogen	70011044
SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets	Sigma-Aldrich	S8820
Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Fisher Scientific, Inc.	78420
Retsch PM100 Ball Mill Grinder	Retsch	20.540.0001
Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar	Retsch	01.462.0148
Ultramicrospin C18 column	The Nest Group	SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18	Waters	WAT043395
TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column	Tosoh Corp.	13071	This is the HILIC chromatographic column.
Guard column 4.6 mm ID x1 cm	Tosoh Corp.	19021	We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column.
PHOS-Select™ Iron Affinity Gel	Sigma-Aldrich	P9740	This is the IMAC resin. Aliquot and store.