Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Özet

Burada izlenir ve sayısal, fonksiyonel moleküler kompleksler tespit sağlamak için canlı bakteri hücreleri tek-molekül floresan mikroskopi gerçekleştirmek için protokolleri göstermektedir.

Özet

Sadece hücresel düzeyde olayları ortaya çıkarmak ve doğrudan temel süreçleri araştıran, canlı hücrelerin mekanizmalarını içine tam fikir elde edilebilir. Yerine nispeten ham dökme topluluk ortalamanın ölçümler kullanılarak yapılan çalışmalarda tek sistemleri odaklanarak, biyolojik sistemlerin kayma karmaşıklığı Bugüne kadar çok talep olması kesin tek molekül deneyler neden oldu. Ancak, çok önemli süreçler, sadece bir düzeyinde yaşayan hücre ya da birkaç molekül oluşur; topluluk ölçümleri genellikle bu olayların stokastik ve heterojen doğası maske. Burada, gelişmiş optik mikroskop ve analitik görüntü analiz araçları kullanarak, tek bir canlı bakteri tek moleküllerin hassas bir hücre ve biyolojik makineleri işleyen moleküler kompleksler içinde dinamiklerini izleyebilirsiniz içinde proteinler izlemek için nasıl gösterilmektedir. Teknikleri fizyolojik doğrudan ilgili. Minimal pertürbatif ve biyolojik örnek çalışma altında non-invaziv ve yaşam malzemesi araştırmalar için tamamen uydurulmuş, biyofizik diğer tek-molekül yaklaşımlara hazır özellikleri. Buna ek olarak, biyolojik örneklerin hepsi doğal olarak ortaya daha belirgin olarak daha fazla protein üretmek için, daha sık ama daha az ideal bir yaklaşım karşı değiştirilmemiş hücre suşları ("genomik kodlama"), hemen hemen aynı seviyelerde floresan etiketli proteini üretmek okudu ("plazmid ifade"). Böylece, gerçek biyolojik örnekler ele alınacaktır doğal organizmalar için önemli ölçüde yakın ve gerçek fizyolojik süreçleri nedenle gözlemler daha uygun.

Protokol

1. Bu yordamı başlamak için, Escherichia coli bakteri hücrelerinin ifade floresan protein dondurulmuş stoklarının 50 ul ilk çözülmüş ve C. sabah 37 derece gecede 5 ml LB büyüme ortamı sallayarak aerobik yetiştirilen, bu doymuş kültür 50 ul ayıklanır 4 ila 6 saat boyunca 30 ° C'de inkübe minimal M63 glikoz kültür ortamı, alt-kültür. Burada, biri bir elektron taşıma ifade iki farklı hücre suşları, açıklamak GFP, GFP için erimiş bakteriyel flagellar motor yer alan bir protein ifade diğer erimiş sitokrom.
2. Hücreler, büyüyen alt-kültür immobilize örnekleri olarak varsa da doğrudan hasat, ya da "gergin" koşullar altında görüntülerken, bakteri kamçısı kesecek makaslanmış olabilir.
3. Kırpma, steril boru ile birleştirilmiş iki steril şırıngalar oluşan bir cihazın içine alt-kültür genellikle 1-5ml yerleştirerek içerir. Kesme dar bir boru aracılığıyla kültür itmek için her şırınga pompası iterek alternatif ile yapılır. Bu gerekli kesme ölçüde bağlı olarak, 50-100 kez yapılır. Kültür kamçı parçalarını kaldırmak için asgari medya yeniden süspanse pelet hücreler, daha sonra santrifüj edilir.
4. Daha sonra 20 dakika için etanol KOH doymuş bir çözüm çeker, sonra de-iyonize su ve etanol iyice durulama ve en az 1 saat boyunca kurumaya bırakarak BK7 cam lamelleri temizlenir hazırlamak
5. Biz hücrelerin mikroskop evine basit bir akış hücresi oluşturmak. Bu parafin yağ hatları BK7 cam mikroskop lamı üzerine çizim ve daha sonra bir tünel sandviç oluşturarak üstüne temizlenir coverlips birini koyarak ve forseps bir çift ile hafifçe aşağı doğru bastırarak, 5-10 ul bir akış hücresi hacmi veren içerir .
6. Immobilize hücreler gözlemlemek için% 0.1 w / v poli-L-lisin bir çözüm akış hücre enjeksiyonu ile doldurmak ve en az 1 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe izin. Daha sonra 100 ul minimal medya akışını hücrenin bir ucundan, medya enjekte ve diğer kağıt mendil ile esneklik kullanarak dışarı floş.
7. Daha sonra lamel yüzey işaretlemek için minimum medya, 200 nm çaplı lateks mikroküreler (Polysciences) bir 1:500 dilüsyon 20 ul fitil. Akış hücre lamel aşağıya doğru, basit bir nem odası yüzey açık bir platform üzerine yerleştirilen karşı karşıya olduğu gibi ters ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. Unbound boncuk sonra 100 ul minimal medya aracılığıyla esneklik yıkanır.
8. Gergin hücreleri gözlemlemek isterseniz, poli-L-lisin adım ihmal ve 5 mg / ml anti-flagellin antikor yerine akış hücre doldurun. Akış hücresi, 10 dakika nem odası yer ve sonra esneklik tarafından temizlendi.
9. Hücre kültürü 20 ul immobilize hücreleri inceleyen gergin hücreleri veya unsheared numune gözlemleyerek, ya makaslanmış örnek kullanarak, akış hücresi ile sonra kötülerin.
10. Akış hücre ters ve 20 dakika boyunca nem odasında yerleştirilir. Unbound hücreler daha sonra 100 ul minimal medya aracılığıyla esneklik tarafından yıkanır.
11. Bir damla immersiyon lamel üst yüzey merkezinde yerleştirilir ve akış-hücreli yüksek sayısal diyafram objektif lens ile optik temas eden, özel inşa edilmiş floresan mikroskop numune tutucu hafifçe yerleştirilir.
12. Elektron mikroskobu çarparak kamera açık ve kamera -70 ° C ye soğutulmalıdır. Ayarlamak, yazılım, başlangıçta kazanç kontrolü disenabling çerçeve transfer modunda 25 Hz tipik bir kare hızında görüntüler elde etmek için ayarlanır kamera.
13. Aydınlık aydınlatma açık ve görüntü lamel yüzey uzun eksenine paralel çakılı olmanın temelinde görüntülü hücreleri uygun bir hücre veya grup seçerek, odak noktası haline getirdi. Odak ince lamel yüzeyine yapışmış 200 nm lateks boncuk sadece odak noktası olmasını sağlamak için ayarlanabilir.
14. Hücre gövdesi taslağını kaydetmek için aydınlık bir görüntü dizisi elde edilir. Aydınlık aydınlatma kapalı ve kamera kazanç maksimum etkindir.
15. Toplam iç yansıma floresan (veya TIRF) uygun dalga boyu üzerinde bir lazer ışını (Burada, yeşil flüoresan protein uyarma, 473 nm lazer) kullanarak, standart bir satın alma için arka odak düzlemi odaklı olacak şekilde önceden ayarlanmıştır. objektif lens ama hücre örneği içine floresans uyarma için kaybolan bir alan oluşturmak üzere optik ekseni yanal yerinden.
16. Kamera alımına başlanması ve lazer deklanşör bakteri içinde floresan proteinleri heyecanlandırmak için açıldı. Lazer yoğunluk ve hız için satın alma parametreleri farklı değerler ile denemeler tarafından soruşturma altında belirli bir biyolojik sistem için optimize edilmiş olması gerekir, ancak tipik bir aralığı r5-40 ms kare başına bir pozlama süresi ile, hücre zarı mobil protein kompleksleri okuyan elevant çapı ~ 30 mikron dairesel bir uyarım alana 1-10 mW lazer güç vardır. Örnekleri photobleached, genellikle ~ 10 sn kadar aydınlatılmış
17. Bu protokol hem vücut hücre lamel ve flagellar saplama arasında ek bir nokta etrafında dönen gergin hücreleri ve katı lamel yüzey sabit hareketsiz hücreler için kullanılabilir.
18. Kompleksleri yüksek bir kopya sayısı bazı hücre suşları TIRF görüntüleme önce hücre tek kutuplu bir başlangıç ​​kırınım sınırlı odaklı lazer çamaşır suyu yarar. Bu çamaşır suyu (ya da sıkı bağlamak) photobleaching sonra floresan kurtarma kullanılan eşdeğerdir. Bizim özel mikroskop kullanarak ikaz lazer ışığı, sıkı bağlamak-tipi beyazlatma için kullanılan ikinci bir bağımsız yoluna beslenebilir. Genellikle 1-10mW lazer güç aralığı 10-300 ms tipik bir çamaşır suyu zaman kullanılır. Bu sonuçlar, daha sonra bu alana daha kolay görüntülenebilmekte diffüz bireysel kompleksleri sağlayan hücre ağartılmış bölge çok daha yüksek görüntüleme kontrast.
19. "Slimfield" olarak adlandırılan farklı bir aydınlatma modu istihdam hücre zarının dışında çok daha hızlı diffüz hücre sitoplazma kompleksleri görselleştirme. Burada odaklanmış bir lazer yanal sadece tek bir hücre kapsayacak şekilde genişletilmiştir. Bu tipik bir milisaniyeden daha hızlı pozlama alınacak izin çok yoğun bir alan üretir.
20. Veri toplama, görüntüler, özel yazılmış yazılım (LabVIEW 8.5 kodlu) beslenir. Bu hücreleri genellikle birkaç nanometre hassas bir floresan noktalar pozisyonları otomatik olarak algılar ve kendi büyüklüğü ve parlaklığı ayıklar. Brightnessof, paletli bir moleküler kompleks zaman saygı ile photobleaching iz sonra stokiyometri tahmin etmek için kullanılan tek bir moleküler kompleks oluşturan kaç bireysel floresan proteinleri yani.

Temsilcisi Sonuçlar:

Protokol yapılır aydınlık içinde görüntülenen hücrelerin düzgün görüntüleri koyu bir beyaz / gri hücre gövdesi (Şekil 1a) karşı hücre gövdeleri çevrelerinin, çok farklı. Floresan immobilize hücreler kullanarak, farklı noktalar genellikle genişliği 250-300 nm (Şekil 1b) yoğunluğu, görebilirsiniz. Sağlıklı, gergin hücreleri aydınlık görüntüler halata eki nokta etrafında döndürmek için görülecektir. Floresans uyarma altında bizim durumumuzda bazı moleküler kompleksler flagellar motor etiketli protein lokalizasyonu gösteren eki noktada olabilir. Bu lekeler, bireysel moleküler kompleksler ve sayıda görülen onları aydınlatma modu ve komplekslerin çoğu aslında herhangi bir zamanda hücrede bulunur bağlıdır. Noktalar hareketlilik çalışma altında belirli bir biyolojik sistem bağlıdır. Lekelerin yoğunluğu başlangıçta çok yüksek ise, sonra bir ilk sıkı bağlamak çamaşır suyu görüntü kontrastı artırabilir gerçekleştirerek, burada kullanılan etiketli sitokromlar durumda.

Şekil 1. (A) aydınlık ve (B) hareketsiz bir Escherichia coli hücre için TIRF (sahte renk) bakteri flagellar motorlar yer olarak bilinen yeşil floresan protein (GFP) erimiş bir protein ifade. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bakım bu yana gergin bakteri bakarak "flagellar motorlar üzerine kesme" hücre işlevlerini bozabilir değil alınmalıdır. Oksijen tükenmiş olabilir hücreleri mikroskop lamı üzerine bir kez bir saat daha uzun kullanmak için önemlidir. Önemli bir optimizasyon en iyi mikroskop görüntüleme koşulları soruşturma altında belirli bir biyolojik sistem yiyecek ve içecek bulmak için gerekli olabilir. Özellikle mikroskop sistemi için gerekli olan doğru yoğunluklu lazer uyarma tespit etmek için t...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.