Kendini yenileme LIF Yokluğunda Mesc Destek SC1 (Pluripotin) kullanımı

Özet

Ras-GAP ve ERK1 çift inhibisyonu yoluyla SC1 fonksiyonları. Biz LIF yokluğunda fare ES hücre kendini yenileme destekleyen SC1 fonksiyonu test edilmiş ve SC1 fare ES hücre kültürleri kendini yenileme korumak mümkün olduğunu göstermiştir.

Özet

Fare embriyonik kök (ES) hücreleri, geleneksel olarak kendini yenileme korumak için lösemi inhibitör faktörü (LIF) ile kültüre.

Protokol

1. MEF besleyici tabak hazırlanması

1. Kültür ES hücrelerinin bir gün önce, bir çözülme bir flakon ışınlanmış E14.5 CF-1 MEF besleyici hücreler (ES hücrelerinin nasıl Çözülme yordama bakın).
2. 10.000 hücrelerinin yoğunluğu Plaka MEF besleyici hücreler / 12 plaka. 37 ° C ve% 5 CO ₂ geceleme hücreleri inkübe edin. MEF hücre medya: DMEM% 10 ES-PBS, 1X glutamin ve 1X non-esansiyel amino asitleri ile desteklenmiştir.

2. Kendinden Fare ES Hücre Yenileyici Bakım

1. Tripsin kullanarak ES hücreleri ayırın. / Iyi büyüme ortamı önceden hazırlanmış MEF besleyici plakaları (Nakavt MEM,% 15 KSR, 4 mM L-glutamin, 0.1 mM non-esansiyel amino asitler ve 1X BME ile desteklenmiş) 50.000 hücrelerinin yoğunluğu Tohum hücreleri SC1 ile desteklenmiş istenilen konsantrasyonda (100 nM 300 nM ve 1 mcM). Ayrıca 1000 μ / ml LIF ile desteklenmiş iyi bir pozitif kontrol ekledi. 37 ° C ve% 5 CO ₂ geceleme hücreleri inkübe edin.
2. Kültür 37 hücreleri ° C ve% 5 CO ₂ 3-4 gün için her pasajda. Yenile medya her 48 saatte.
3. Passage hücreleri ilk tohumlama yoğunluğu gibi benzer bir yoğunluğunu korumak için tripsin ile 1:10 - 1:15. 5 pasajlar sonra, hücreler tipik pluripotency belirteçlerin immünsitokimya kullanarak ifade için incelenebilir.

3. Pluripotency Belirteçleri İmmünositokimyasal Sınav

1. Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın.
2. 500 oda sıcaklığında 20 dakika fiksatif ul hücreleri sabitleyin.
3. Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın.
4. Oda sıcaklığında bir saat için 500 ul engelleme tampon ile non-spesifik bağlama engelleyin.
5. 250 ul spesifik primer antikor (1:500, 1:2000, 1:500, 1:500 aşağıdaki dilüsyonları Nanog, Sox2, SSEA1 ve Oct4) hücreleri inkübe
6. Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın.
7. (1 1:2000 ve eşek Alexa Fluor ® 488 anti-tavşan konjuge anti-fare Alexa Fluor konjuge ® 555 eşek kullanılan ışıktan uzak tutarak, ikincil antikor 250 ul hücreleri iki saat oda sıcaklığında inkübe edin. : 2000).
8. Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın.
9. Son yıkama DAPI (son konsantrasyonu 1 mcg / ml) ve çekirdekleri görselleştirmek için 5 dakika inkübe edin.
10. Floresan mikroskop altında hücrelerin analiz edin.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

1. Morfoloji sonuçları:

Fare ES hücrelerinin (ESC R1), farklılaşmamış bir halde kendini yenileme sürdürmek için ya LIF veya SC1 varlığı MEF besleyici hücreler yetişen. Ikinci geçit sonra LIF veya SC1 (negatif kontrol) olmadan, farklılaşma hücrelerinde gözlenen olabilir ve 5 pasajlar sonra aslında hiç farklılaşmamış koloniler gözlenmiştir. LIF (pozitif kontrol) tedavi koloniler 5 hücre pasajlar boyunca farklılaşmamış bir devlet kaldı. 300 nm veya 100 nM konsantrasyonlarda SC1 ile tedavi Hücreler aynı zamanda 5 pasajlar sonra farklılaşmamış kaldı, ancak, hücrelerin dördüncü geçtikten sonra 1 mcM SC1 deneyimli hücre ölümü ile tedavi. (App not şekil 2) Tablo 1 gözlemler özetlenmiştir.

2. Pluripotency Markers İfadesi

5 pasajlar sürdürülen Fare ES hücrelerinin SSEA1, Oct4, Nanog ve Sox2 için sabit ve immünsitokimya tarafından incelendi. Marker ifade LIF muhafaza hücreleri için benzer. (App not şekil 3 ve 4)

Şekil 1: LIF veya SC1 muhafaza hücreleri Morfoloji karşılaştırılması. Morfoloji açısından fark yok gözlendi.

Şekil 2 ve Şekil 3: Nanog, SSEA1, Sox2 ve bakımı, SC1 veya LIF (app not şekil 4) ile ES hücrelerinin Oct4 boyama . SC1 olarak tutulan hücreler LIF muhafaza hücreleri için benzer pluripotency işaretleyici ifade göstermektedir.

Tablo 1

	Negatif Kontrol	LIF Pozitif Kontrolü	SC1 1uM	SC1 300 Nm	SC1 100 Nm
1. Passage	Normal ES hücre morfolojisi	Normal ES hücre morfolojisi	Normal ES hücre morfolojisi	Normal ES hücre morfolojisi	Normal ES hücre morfolojisi
2. Passage	Bazı farklılaştırılmış morfolojisi	Normal DS hücre morfolojisi	Normal ES hücre morfolojisi	Normal ES hücre morfolojisi	Normal ES hücre morfolojisi
3. Passage	Farklılaşmış hücrelerin büyük bir çoğunluğu	Normal ES hücre morfolojisi	Normal ES hücre morfolojisi	Normal ES hücre morfolojisi	Normal ES hücre morfolojisi
4. Passage	Yok ESC koloniler	Normal ES hücre morfolojisi	Hücre ölümü gözlenen	Normal ES hücre morfolojisi	Normal ES hücre morfolojisi
5. Passage	farklılaştırılmış	Normal ES hücre morfolojisi	Hücre ölümü gözlenen	Normal ES hücre morfolojisi	Normal ES hücre morfolojisi

Tartışmalar

Küçük molekül SC1 fare ES hücreleri farklılaşmamış bir devlet ile kendini yenileme korumak için kullanılabilir. Ancak, denenmemiş bir hücre hattı kullanmadan önce, optimal konsantrasyonunu belirlemek için titre edilmelidir. Örneğin, fare ES hücre hattı ESC R1 üç konsantrasyonları test etti. 100 nM ve 300 nM konsantrasyonlarda fare ES hücrelerinin sürdürmek başardık, ancak 1 mcM konsantrasyonu toksik oldu.

SC1 aynı zamanda besleyici-koşullar altında kullanılabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
SC1	Stemgent	04-0011
LIF	EMD Millipore	ESG1107
SSEA-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	21702
Nanog antibody	Abcam	ab21603
Sox2 antibody	Chemicon International	Ab5603
Oct4 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-5279