Mikotoksin Algılama ELIME (Enzim İmmüno Manyetik Elektrokimyasal Bağlantılı) Yöntem

Özet

Trichothecenes (insan sağlığı için endişe mikotoksinler) rekabetçi bir immünokimyasal yöntemi ve bir final elektrokimyasal algılama dayalı yeni geliştirilen bir tarama yöntemi kullanılarak tespit etmek için bir protokol olduğunu göstermiştir.

Özet

Immunoassay daha pahalı ve zaman alıcı kantitatif HPLC veya GC ^{1 2 yöntem,} gıda malları tehlikeli mikotoksinler tarama algılama için geçerli bir alternatif. Bu protokolde algılama platformu olarak immünokimyasal zinciri ³ ve serigrafi elektrotlar için sağlam bir destek olarak manyetik boncuk kullanımı dayalı bağlantılı immunomagnetic tahlil imal ve rekabetçi bir elektrokimyasal Enzim sorguya nasıl göstermektedir.

Bizim yöntemi HT-2 ve T-2 toksinleri trichothecenes aile ve insan sağlığı ⁴ için büyük bir endişe ait toplam tutarı, mikotoksinler belirlenmesi amaçlanmıştır. % 100 HT-2 ve T-2 doğru bir çapraz reaksiyon ile bir antikor klon benzer hassasiyet ⁵ ile aynı anda iki toksinler tespit etmek için sağlar .

Testinin ilk adım, biz yüzey üzerinde manyetik boncuk HT2-KLH konjuge toksin hareketsiz kaplama adımdır. Immobilize HT-2 ve HT-2 ya da T-2 örnek ücretsiz mevcut veya standart bir çözüm çözünmüş arasındaki rekabet, non-spesifik emme önlemek için gerekli engelleyici bir adım sonra, monoklonal antikor Ayrıca sağlar.

Rekabet adım sonunda, monoklonal antikor miktarı ile bağlantılı HT-2 örnek çözüm toksin miktarı ile ters orantılı olacaktır immobilize.

Alkalen fosfataz (AP) ile etiketlenmiş ikincil bir antikor spesifik antikor ve hareketsiz HT-2 arasındaki bağlayıcı ortaya çıkarmak için kullanılır. Son ölçüm adım ekran baskılı bir çalışma elektrot yüzeyinde belirli bir örnek / standart bir çözüm karşılık, manyetik boncuk süspansiyonu bir kısım bırakarak yapılır; altında tam olarak yerleştirilen bir mıknatıs sayesinde manyetik boncuk immobilize ve konsantre ekran basılmış elektrot. Manyetik boncuk ve AP için bir substrat arasında kuluçka iki dakika sonra, enzimatik ürün birkaç saniye bir süre içinde otomatik olarak sekiz ölçümler başlatmak için ayrıca taşınabilir bir enstrüman (PalmSens) kullanarak Diferansiyel Puls Voltametri (DPV) tarafından algılanır.

Protokol

1) Engelleme kaplı Manyetik Boncuk:

Kaplı Manyetik boncuk engellemek için takip devam edin:

1. 2 ml Eppendorf tüpleri bir dizi hazırlamak;
2. (Vorteks sıkıyorlar ama) örnek dönen mikser ile kaplı manyetik bilye (kaplı manyetik boncuk hazırlanması için eke bakınız) homojenize
3. Homojenizasyon hemen sonra, her biri ayrı Eppendorf tüp içine kaplı manyetik bilye pipet 10 ul;
4. Kümesinin her Eppendorf tüp içine çözümü engelleme yağsız süt 1 ml ekleyin;
5. Dönen örnek karıştırıcı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe manyetik boncuk edelim;
6. Çözümü engelleme kaldır: 2 dk (tüp lateral duvara yapışan manyetik boncuk görmek) koymak manyetik manyetik partikül konsantratör tüp bunu dikkatle boncuk bozulmamış bırakarak, süpernatantı pipetle;
7. PBS + NaN ₃ + BSA her tüp için depolama çözümü olarak 1 ml ekleyin;
8. 4 kaplı ve bloke manyetik boncuk Mağaza ° C (kaplı manyetik boncuk 4 ° C 'de en az 2 ay için kararlı olduğunu lütfen unutmayın);

2) kalibrasyon eğrisi inşaat ve numune analizi için manyetik boncuk İmmünolojik zinciri

Ölçümü için hazır manyetik boncuklar var aşağıdaki gibi devam edin:

1. Kaplı ve bloke çözüm, analiz için gidiyoruz her örnek ayıklamak için bir Eppendorf tüp (2 ml) ele alalım;
2. Her çalışma kalibrant çözeltisi için ekstra bir Eppendorf tüp;
3. Manyetik boncuk, kullanmadan önce dönen bir örnek karıştırıcı 2 dakika süreyle homojenize;
4. Manyetik parçacık konsantratör kullanarak depolama sıvı çıkarın;
5. PBS / BSA yıkama solüsyonu ile manyetik bilyeler üç kez yıkayın. Sıvı çamaşır çıkarın;
6. Rekabet adım: yıkanmış manyetik boncuk, örnek hazırlanmış ayıklamak 200μl içeren her tüp için ekleyin; her bir örnek için bir manyetik boncuk tüp kullanın. Her bir standart çözüm için aynı prosedürü tekrarlayın. Her manyetik boncuk tüp 200 ul monoklonal antikor çözüm ekleyin. Manyetik boncuk, oda sıcaklığında dönen örnek karıştırıcı yarım saat boyunca inkübe edelim;
7. Eppendorf tüpleri rekabet adım için kullanılan çözüm çıkarın;
8. Adım Etiketleme: Her bir manyetik boncuk Eppendorf tüp etiketli ikincil antikor 400μl ekle . Manyetik boncuk, oda sıcaklığında dönen örnek karıştırıcı yarım saat boyunca inkübe edelim;
9. Eppendorf tüpleri çözümü etiketleme çıkarın;
10. Manyetik boncuk, PBS / TWEEN ® 20 yıkama solüsyonu ile üç kez yıkayın. Sıvı çıkarın;
11. DEA tampon 100μl manyetik boncuklar her kısım süspanse edin. Şimdi manyetik boncuk elektrokimyasal ölçüm adım için hazır;

3) Meclis Çoklayıcı (Mux) seçenekleri ile PalmSens

Lütfen dikkat: substrat hidrolizi enzimatik ürün elektrot yüzeyi fauller, bu nedenle yeni bir elektrot her bir ölçüm için gerekli.

1. PalmSens seri kablo aracılığıyla bir PC dizüstü bağlayın;
2. PalmSens CH8 Multiplexer 9-DIN fişini.
3. CH8 Multiplexer ile sekiz kanal Mux elektrik kontağı seri kablo bağlayın;
4. Sekiz mıknatıs blok yerleştirin elektrot şerit. Mıknatıs her çalışma elektrotları altında her yere dikkat edin (not, her elektrot için tek bir mıknatısın manyetik parçacık aksi çalışma elektrot alana konsantre olmaz şarttır);
5. Sekiz kanal Mux elektrik temas elektrotlar şerit takın;

DPV ölçümü için uygun kutulara aşağıdaki parametreleri kullanın:
E başlar: 0 (V); E sonu: 0.6 (V); D adım: 0.016 (V); E darbe: 0,0339 (V); E Klima: 0 (V); E birikimi: 0 (V); Tarama hızı : 0.1 (V / s); T darbe: 0.06 (lar); T Klima: 0 (lar); birikimi T: 0 (s), T dengeleme: 8 (ler).

4) Enzimatik reaksiyon ve Elektrokimyasal Ölçüm

1. Eppendorf tüp manyetik boncuk iyi dağılmış bir süspansiyon elde etmek için elektrokimyasal ölçüm adım için hazır manyetik boncuk içeren her hafifçe sallayarak homojenize;
2. Homojenizasyon sonra hemen her Eppendorf Pipet, ilgili çalışma elektrot yüzeyine manyetik boncuk dağılım 20 ul bir kısım. 20 farklı Eppendorf tüpleri (örneğin sekiz elektrot kullanımı sekiz farklı Eppendorf) alınan manyetik boncuk ul bir şerit kullanımı her elektrot için;
3. Ilk elektrot üzerinde 80 ul enzimatik substrat çözeltisi ekleyin. 2 dakika geri sayım başlayın. 14 saniye sonra ikinci bir elektrot 80 ul enzimatik substrat çözeltisi ekleyin. Daha fazla 14 saniye sonra, üçüncü elektrot 80 ul enzimatik substrat çözeltisi ekleyin. Aynı zamanda int devamerval son elektrot (: 14 sn aralıklarla substrat her bir kısım düşmesi anlamına gelir) kadar (14 saniye). 14 saniye zaman aralığı potansiyostat ölçüm gerçekleştirmek için gerekli olan süre olarak hesaplanır; nota, her bir sensör 80 ul çözüm, çalışma ve referans elektrot kapsamalıdır. Ayrıca, her bir sensör için çözümler komşu elektrot çözümleri ile temas edilmemelidir.
4. 2 dk enzimatik substrat çözeltisi ilk ek geri sayım sonra, elektrokimyasal ölçümü başlatmak;
5. Her çözüm için geçerli zirveleri (uA) elde etmek için PalmSens Lite yazılımı kullanın.

5) Hesaplama

Bir lojistik 4 parametreleri denklemi kullanarak bir kalibrasyon eğrisinin oluşturulması ve bilinmeyen numuneyi içeren her Eppendorf tüp mililitrede nanogram HT-2/T-2 toksin miktarı toplam konsantrasyonu hesaplamak.

Calibrants konsantrasyonu (ng / ml) karşı tepe yüksekliği (uA), deneysel veriler, doğrusal olmayan dört parametreli lojistik Sigma Arsa 8.0 veya kullanarak denklem arsa (1) ((4-PL) kullanarak takılacak Kaleidagraph). Doğrusal olmayan 4-PL modeli genellikle ligand bağlayıcı deneyleri (LBAs) ⁶ tanımlamak için benimsenmiştir.

(1)
Sigma Arsa eğrisi uyum programı tarafından verilen a, b, y0 lojistik parametreleri x0 vardır.
Seyreltilmiş numune ekstresi çözümü HT-2/T-2 toksin toplam miktarın içeriğini hesaplamak için açiklanabilir formülü kullanın
(2)
x milliltre ortalama nanogram lojistik 4 parametreleri Denklem (ng / ml) hesaplanan Seyreltilmiş ekstrakt çözüm HT-2/T-2 toksinlerin toplam miktarın kütle konsantrasyonu
y uA geçerli değeri bilinmeyen numune için elde edilen

Ek

6) Kaplı Manyetik Boncuklar

Kaplamalı Manyetik boncuklar var aşağıdaki gibi devam edin:

Prosedürü Yıkama

1. Tosylactivated Dynabeads homojenize ® M-280 (stok solüsyonu 2 x 109 boncuk / ml) 1 dakika (köpük kaçının) (lütfen manyetik boncuk konsantrasyon sağlamak için tekrarlanabilirliği her zaman aynı olması gereken sallayarak ve vorteks (maksimum hız) ölçümü);
2. Hemen 2 ml Eppendorf tüpe 1 mL pipetle yukarıdaki homojenize boncuk;
3. 2 dk (tüp lateral duvara yapışan manyetik boncuk görmek) koymak manyetik manyetik partikül konsantratör tüp Yeri;
4. Dikkatlice boncuk bozulmamış bırakarak, süpernatantı pipetle;
5. Eppendorf tüp manyetik parçacık konsantratör çıkarın ve 1 ml 0,1 M borat tamponu pH 9.5 boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin. 2 dakika süreyle, 2 dakika süreyle dönen örnek mikserde yavaşça karıştırın;
6. Süpernatantı kapalı Pipet;
7. Pipet borat tampon çözelti Eppendorf tüp içine 1 ml. Manyetik boncuk kaplama adım için hazır;

Kaplama prosedürü

8. Inkübe manyetik boncuk ve HT-2-KLH çözümü için; KLH (Keyhole limpet hemosiyanin) stok manyetik boncuk, 1 ml çözelti) (375 mg / ml son HT-2-KLH konsantrasyon) ile HT-2 konjuge 600 ml 20h 37 ° C * Örnek mikser dönen yavaş eğim rotasyon;
9. Inkübasyon yer süpernatantı kapalı manyetik parçacık konsantratör ve pipet tüp sonra;
   1 ml PBS / BSA tampon çözelti ile kaplı boncuklar iki kez yıkayın. Her yıkama arasında PBS / BSA çözüm çıkarın. Tüm yıkama adım 5 dakika boyunca devirli manyetik boncuk ve PBS / BSA yapıldı;
10. 1 ml TRIS / BSA tampon çözeltisi kullanılarak manyetik boncuk bir kez yıkayın. TRIS / BSA çözüm çıkarın. 37 az 4 saat süreyle mikser dönen manyetik boncuk ve TRIS / BSA tampon ayarlayarak bu adımı yürütmek ° C;
11. Yenilenir 1 ml (4 ° C) PBS / BSA tampon çözelti buzdolabında saklanır kullanarak manyetik boncuk bir kez yıkayın PBS / BSA çözüm çıkarın. Oda sıcaklığında 5min için mikser dönen manyetik boncuk ve PBS / BSA tampon bu adımı yürütmek;
12. Adım, tüm yıkama sıvı eklemek kaldırmak ve yıkadıktan sonra 1 ml PBS + NaN ₃ + BSA depolama sıvı olarak;
13. Kaplı manyetik bilye Mağaza, 4 ° C (kaplı manyetik boncuk 4 en az 2 ay için kararlı olduğunu lütfen unutmayın ° C);

* Bu amaç için güç kaynağı için kablo ekleme sağlayan bir delik ile donatılmış fırında karıştırıcı yerleştirilir. Alternatif olarak, mikser ° C 37 ° mostatlı bir odada yer olabilir

7) Numune hazırlama ve ekstraksiyon

25 g (bebek maması ya da kahvaltılık tahıllar) ince öğütülmüş örnekblender kavanoza ighed ve yüksek-hızlı blender 3 dakika asetonitril / su solüsyonu (86/14) 100 ml ile ekstrakte. 5 dakika için 4000 rpm (3000 gr), 8 ml süpernatant Mycosep sütun ile çekilen ve saflaştırılmış santrifüj sonra, temizlenmiş özü 4 ml azot akışı altında kurutuldu. Kurutulmuş numuneler -30 ° C'de birkaç ay saklanabilir.

8) Örnek sulandırıldıktan

Kahvaltılık tahıl ürünleri

Sulandırın 40 ml PBS pH 7.4 ile kuru kahvaltı gevreği ekstresi (tahıl bazlı gıda yetişkin tüketimi için mukadder). Bu şekilde sözde yasal sınırın (200 ng / g) eşit toksin konsantrasyonu ile örnek bir çalışma aralığı ortasına düşen bir sinyal ölçüm adımda verecektir.

Bebek maması

4 ml PBS ile sulandırın kurutulmuş bebek maması ekstresi (tahıl bazlı gıda bebek tüketimi için mukadder). Bu şekilde sözde yasal sınırın (20-25 ng / g) eşit toksinlerin bir konsantrasyon ile örnek bir çalışma aralığı ortasına düşen bir sinyal ölçüm adımda verecektir.

Tartışmalar

Biyomoleküler tanıma prob olarak antikorların kullanımı yaygın bir algılama teknolojileri kullanımı gördü; ELISA'larla ve MEIAs immünokimyasal algılama yöntemleri, en çok kullanılan ve uygulanan birçok laboratuvarda ⁷ platformlar arasında, günümüzde,.

Bu yaklaşımların son yıllarda olağanüstü bir duyarlılık ve özgüllük, birçok araştırma grubu birincil hedefi elde ederken, kendi performansları ve iyileştirme ve optimizasyon olmuştur.

Malzemeler

Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Potasyum klorür	Sigma	P9333
Potasyum dihidrojen fosfat	Sigma	P9791
Disodyum hidrojen fosfat	Sigma	S3264
Sodyum klorür	Sigma	S3014
MgCl 2 susuz	Sigma	M8266
DEA (% 99.5)	Sigma	31589
HCl 37%	Sigma	320331
H 3 BO 3	Sigma	B6768
Tris [hidroksimetil] aminomethane	Sigma	252859
BSA (sığır serum albumin)	Sigma	A4503
NaOH	Sigma	S5881
TWEEN 20	Sigma	P9416
NaN 3	Aldrich	71290
1-naftil fosfat disodyum tuzu	Fluka	N7255
Yağsız süt engelleme çözümü olmayan yağlı süt kuru maddesi	Bio-Rad	170-6404
KLH (Keyhole limpet hemosiyanin) stok solüsyonu (PBS 1 mg / ml) ile HT-2 konjuge:	Biopure	004050	HT-2-KLH konjugatı HT-2 toksin pozisyon 3 ve 4 serbest OH grupları N, N'-carbonyldiimidazole (CDI) ve aktif HT-2 toksin tarafından aktive edilmiştir CDI yöntemi ile elde edildi protein (KLH) aminogroups ile istikrarlı bir carbammate bağ oluşturmak için tepki sağlar.
İkincil etiketli antikor atı anti-fare IgG (H + L) ile konjuge Alkalen Fosfataz, konsantrasyonu 1 mg / ml.	Vektör Laboratuvarları	AP-2000
HT-2 toksin	Biopure
Manyetik boncuk: Dynabeads ®	Dynal	M-280 Tosylactivated	Konsantrasyon 2 x 10 9 boncuk / ml.

Reaktifin Adı	Hazırlık	Yorumlar (isteğe bağlı)
Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4	900 ml su, 0.20 g, potasyum klorür, potasyum dihidrojen fosfat 0.20 g, 1.16 g disodyum hidrojen fosfat ve 8.00 g sodyum klorür çözülür
Diethanolamine tampon, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl 2 + 0.15 M KCl, pH 9.8	MgCl 2 susuz ve su ~ 300 ml KCl 7.3.59 g 0.0476g çözülür. Dağılmasından sonra 51 ml (% 99.5), DEA ekleyin. HCl (6 M) ile pH 9,8 'e ayarlayın. 500 ml su ile seyreltilir.
Borat tamponu, 0.1 M, pH 9.5	3.09 g H 3 BO 3 ~ 300 ml distile su içinde çözülür, NaOH ve / veya HCl (6 M veya düşük konsantrasyonlarda) ile 9.5 pH ayarlamak. 500 ml saf su ile seyreltilir.
TRIS tampon, 0.2 M, pH 8.5	3.85 g Tris [hidroksimetil] 100 ml su-aminomethane çözülür. NaOH ve / veya HCl (6 M veya düşük konsantrasyonlarda) ile pH 8.5 'e ayarlayın. 200 ml su ile seyreltilir.
TRIS tamponu + BSA solüsyonu (% 0.1), pH 8.4	TRIS tampon pH 8,4 50 ml BSA 0.050 g eritin.	Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır.
PBS + TWEEN ® 0.05%	Önceden hazırlanmış PBS, pH 7.4 500 ml 0.250 g TWEEN 20 çözülür
PBS + BSA çözüm% 0.1	PBS, pH 7,3 - 50 ml BSA 0.050 g eritin.	Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır.
PBS + BSA% 0.1 + NaN 3 0.02%	PBS, pH 7,3 - 50 ml BSA g 0.050 ve 0.010 NaN 3, eritin .	Depolama solution
Enzimatik substrat	DEA tampon pH 9.8 100 ml, 0.010 g 1-naftil fosfat sodyum tuzu eritin. Sıkı şişeyi alüminyum folyo ile sarın.	Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır.
Yağsız süt bloke çözüm	Sınıf Engelleyicisi Non-Fat Kuru Süt (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) Blot PBS pH 7.3 200 ml 0,20 g ekleyin.	Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır.
HT-2 stok solüsyonu	10 ml vermek asetonitril, trikotesen HT-2 toksin flakon 10 mg çözülür 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyon ile bir çözüm.	30 ml tek kullanımlık alikotları bu çözüm Split ve -30 ° C'den daha az saklayın
HT-2 standart çözüm Çalışma	Pipet 20 ml HT-2 toksin stok solüsyonu 2 ml ölçülü balona kalibre ve 10 mg / trikotesenler toksin ml içeren bir HT-2 çözüm elde etmek için asetonitril ile seyreltilmiş.	Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmalıdır.
HT-2 Çalışma kalibrant çözümler	Kalibrant çözeltisi 100 ng / ml hazırlamak için HT-2 standart solüsyonu (10 mg / ml) sulandırınız. Sulandırınız HT-2 kalibrant çözeltisi çalışan 100 ng / ml aşağıdaki konsantrasyonları 0 (boş), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng / ml kalibratörü çözümler çalışmaya hazırlamak için.	Bu çözümler, kullanım gün taze olarak hazırlanması gerekir.
HT-2 KLH ile konjuge	350 ul tek kullanımlık alikotları KLH (Keyhole limpet hemosiyanin) stok solüsyonu (PBS 1 mg / ml) ile HT-2 konjuge Böl.	-30 ° C'de saklayın alikot
Spesifik Monoklonal Antikor	Rekabet adımda kullanmak için PBS monoklonal antikor stok konsantrasyonu (1,383 mg / ml): 1:350 (v v) sulandırınız	Bu çözüm, kullanım an taze hazırlanmış olmalıdır. Son bir hacim 3,5 ml PBS 10 ml antikor stok solüsyonu, 17 standartları ve / veya numune analiz etmek yeterli değildir.
İkincil Etiketli Antikor	PBS içinde rekabet adımda kullanmak için: Alkalen Fosfataz ile konjuge anti-fare IgG (H + L) 1:100 (v v) seyreltilir.	Son hacim 10 ml PBS 100 ul antikor stok solüsyonu, 25 standartlara ve / veya numune analiz için yeterli. Bu çözüm, kullanım an taze hazırlanmış olmalıdır.

Reaktifin Adı	Şirket	Yorumlar (isteğe bağlı)
Manyetik Parçacık Yoğunlaştırıcı: MPC ®-S	Dynal
PalmSens enstrüman	PalmSens	Seri kablo bağlantı PC dizüstü bilgisayar ve Mux seçenekleri yazılım PalmSens Lite, ile birlikte verilen
CH8 PalmSens Multiplexer	PalmSens
Sekiz kanal Mux elektrik kontağı	el yapımı
Sekiz serigrafi elektrotlar (SPES) ile sıyırın	el yapımı
Elektrotlar şerit için özel olarak tasarlanmış destek	el yapımı	SPE her çalışma elektrot yüzeyinin altında yerleştirilmiş, her biri 8 neodim mıknatıslar
Kalibreli mikrolitrelik pipetler	Gilson
Manyetik karıştırıcı ve heyecan bar.
Cam bardak (100, 50, 20 ml).
Volumetrik şişeler (2 ml).
0.2 ve 2 ml Eppendorf tüpleri.	Eppendorf
5ml, 15ml Falcon ™ tüpleri.	Şahin
Laboratuvar Vorteks Karıştırıcı		Proteic parçalarının denatüre önlemek için HT2-KLH ile kaplanmış veya bağlantılı manyetik boncuk immünolojik zinciri ile tekrar süspansiyon vorteks mikser kullanmayın
Laboratuvar fırın veya mostatlı oda		37 ± 3 ° C lik bir sıcaklık tutmak için bir fırın seçin