Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

Özet

Bitki materyali belirli hücre türlerini izole etmek için kullanılan bir yöntem olduğunu göstermiştir. Bu teknik, özellikle hücre tipleri, hücresel bölünmeler ve Floresans Aktif Hücre Sıralama floresan proteinleri ifade transgenik işaretleyici hatları kullanmaktadır. Ayrıca, büyüme kurulumu kolaylaştıran tedavisi burada kuruldu Arabidopsis thaliana Hücre sıralama önce fide.

Özet

Yüksek çözünürlüklü, gen ekspresyonu hücre tipi özel analiz gelişim düzenleme ve herhangi bir çok hücreli bir canlının çevresel uyaranlara verilen yanıtlar anlayışı büyük ölçüde artırır. In situ hibridizasyon ve raportör gen görselleştirme kantitatif sınırlı bir ölçüde bu amaçla kullanılabilir ama yüksek çözünürlüklü RT-PCR veya özel hücre tiplerinden yüksek verim transcriptome çapında analiz RNA izolasyonu şarttır. Belirli bir hücre tipi ve sonraki Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) floresan proteini işareti ifade doku Hücresel disosiyasyon mümkün RNA ekstraksiyon, cDNA sentezi / amplifikasyon ve mikroarray analizi için yeterli miktarda malzeme toplamak için yapar.

Hücre tipi özel floresan muhabiri hatlarının geniş bir bitki araştırma topluluk için kullanılabilir. Bu durumda, Arabidopsis thaliana kök iki belirteç hatları kullanılır: P _SCR: GFP (endodermis ve latent merkezi) ve P _WOX5: GFP (latent merkezi). Fideler çok sayıda (binlerce) hydroponically veya agar plaklarına büyüdü ve daha fazla analiz için yeterli kök malzeme elde etmek için hasat edilir. Hücresel disosiyasyon bitki materyali hücre duvarının enzimatik sindirimi ile elde edilir. Bu prosedür yüksek ozmolarite indüklenen plasmolysis ve piyasada mevcut sellülazlar yapar, pectinases ve hemicellulases çözüm protoplast serbest bırakmak için.

GFP pozitif hücreler FACS 488 nm lazer tarafından heyecan protoplast kırmızı emisyon spektrumları karşı yeşil görselleştirme yapar. GFP pozitif protoplast yeşil kırmızı salma artan oranı ile ayırt edilebilir. Protoplast genellikle doğrudan RNA ekstraksiyon tamponu içine sıralanır ve daha sonraki bir zamanda daha fazla işlem için saklanır.

Bu teknik, basit ve uygulanabilir olduğu ortaya. Ayrıca, çok kıt hücre tipleri (örneğin latent merkezi hücreleri) için bile, transcriptome analizi için yeterli sayıda hücre izole etmek için zorluk olmadan kullanılabilir olması gösterilmiştir. Son olarak, Arabidopsis fide için bir büyüme kurulum (örneğin hücre tipi özel biyotik veya abiyotik stres tepkileri analiz için) hücre sıralama önce bitkilerin komplikasyonsuz bir tedavi sağlar gösterilmiştir . Potansiyel ek bitki protoplast FACS tartışılmıştır kullanır.

Protokol

1) bitki materyali hazırlanması

1. Protoplast sindiren enzimleri hücre duvarının sağ karışımı ¹ olduğunu sağlanan pek çok farklı bitki türlerinin ve dokular elde edilebilir. Tam ölçekli bir deney yapılmaktadır önce, küçük ölçekli bir sindirim malzeme, doku protoplasting verimliliği, enzimler, vb değerlendirmek ve hücre sıralama için yüzde pozitif hücrelerin tahmin etmek için tavsiye edilir. Burada, hücre tipi, özellikle açık yeşil flüoresan protein (GFP) kullanılır olduğunu Arabidopsis thaliana fide kökleri elde edilen protoplast . Endodermis ve latent merkezi P _SCR tarafından işaretlenir: GFP ve P _WOX5 latent merkezi: GFP ^2,3 (Şekil 1).
2. Kökleri (% 0.22 w / v Murashige ve Skoog Bazal Orta [Sigma],% 1 büyüme ortamına yoluyla büyümeye olanak sağlar; naylon filtre (NITEX 250 mikron mesh); Fideleri (Şekil 2a Sigma) phytatrays hydroponically yetiştirilen w / v sakaroz,% 0.05 w / v MES [2 - (N-morfolino) ethanesulfonic asit], KOH ile pH 5.7). Alternatif olarak üst üste dikey olarak yerleştirilmiş% 1 agar plaklarına bir naylon filtre (100 mikron mesh) (Şekil 2b), bitkiler yetiştirilebilir.
3. Köklerin hasat sadece yardımların yukarıda belirtilen filtreleri kullanmak istenirse, o da kolay, fide ek tedavi kolaylaştırır. Filtreler fide ilgi bir katalizör ile desteklenmiş yeni phytatrays veya agar plaklarına topluca aktarılacak izin verir. Örneğin, phytatray seti Arabidopsis fide azot tedavisi ⁴ transkripsiyonel yanıt hücre tipine özgü analizi için kullanılan olmuştur.
4. Mikroskobik floresan işaretleyici doğru ifade olduğunu (kendilerini tedavi etkilemiş olabilir, hücre tipi özel işaretleri olarak tedavi seçeneği kullanarak özellikle) emin olun. Bu durumda, fide, floresan mikroskop altında incelenmelidir (Şekil 1 Nikon). Hücre tipi özel floresan işaretleyici hatları tam olarak hangi hücre tipleri işaretlenmiştir belirlemek ve ifade değişkenlik belirlemek için bir konfokal mikroskop altında başlangıçta karakterize gerektiğini unutmayın.

2) Hazırlık protoplasting çözüm

1. 1.25% w / v selülaz (Yakult),% 0.3 w / v Macerozyme (Yakult), 0.4 M D-mannitol, 20 mM MES ve 20 mM KCl demineralize su (1 M stok) çözülür ve pH 5.7 'ye ayarlayın 1 M Tris / HCl pH: 7.5. Bu çözüm biraz bulanık olacaktır.
2. Çözüm ile 55 Isı ° C, 10 dakika (çözüm açık dönecek) ve% 0.1 eklemeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin w / v BSA (sığır serum albumin), 10 mM _CaCl 2 ve 5 mM β- mercaptoethanol .

3) Hasat ve bitki materyali, protoplasting

1. Kökleri bir neşter ile naylon mesh onları kazıyarak hasat ve protoplasting çözüm içeren bir balona yatırılır. Genel olarak, 10 ml protoplasting çözüm 1.500 fide kökleri başına kullanılır.
2. Bir saat boyunca oda sıcaklığında matara (75 rpm) hafifçe çalkalayınız. Daha uzun bir kuluçka süresi protoplast verimi artırabilir, ama aynı zamanda gen ekspresyonu üzerine kendisi protoplasting etkisi eklemek olacaktır.
3. 40 mikron hücre süzgeç (BD Falcon) protoplast çözüm Filtre ve konik 15 ml tüpler (BD Falcon) üzerinden çözüm bölmek.
4. 500 G. Not Bu santrifüj hızı kullanılan protoplast tipi, kırılganlık ve enzimatik tedavi sırasında üretilen hücre enkaz miktarı bağlı olacağını, 10 dakika boyunca bir salıncak-kova santrifüj tüpleri dönerler.
5. Süpernatantı çıkarın, kalan çözüm protoplast tekrar süspansiyon ve mikroskobik olmadığını kontrol edin (Şekil 3).
6. Protoplast sayısını ve yoğunluğunu tahmin etmek için bir hemasitometre yararlanın. Hücre yoğunluğu örnek enjeksiyon hızı, FACS hücreler sıralamak için gerekli olan ikinci sınıf başına olaylar ve bu nedenle toplam süre (bkz. bölüm 4.3) belirleyecektir.
7. 3.7) FACS doğrudan devam etmek ya da olmadan, W5 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, 5 mM (MES), KOH ile pH 5.7 'ye ayarlamak) veya protoplasting çözüm olarak bir kuluçka çözüm, protoplast yıkayın ve tekrar süspansiyon Ya enzimler eklendi. Özellikle transkripsiyonel değişiklikler bakarak, protoplast Bu nedenle protoplasting çözüm protoplast tutmak ve devam etmek için tavsiye edilir tutulur tampon değiştirme gibi örneklerinin gen ekspresyonu etkileyebilecek koşullara maruz kalma, en aza indirmek için önem taşımaktadır. mümkün olan en kısa sürede FACS.

4) Floresan protoplast Aktif Hücre Ayırma

1. Açın ve hücre sıralayıcı hazırlamak. Burada, bir FACSAria (BD) kullanılır.
2. 100 & m olan bir akım akışıu; m meme ve 20 psi kılıf basınç.
3. Hücre yoğunluğu ve numune enjeksiyon hızı, mümkün olan en iyi verim veya hızlı ulaşılabilir hızı istenilen olup olmadığına göre belirli bir deneme için ayarlanabilir. Biz 10.000.000 hücre / ml 'ye kadar yoğunlukları ile başarılı bir şekilde sıralanır var.
4. Protoplast sedimantasyon önlemek için FACS örnek ajitasyon seçeneği kullanın. 1: FACS tıkanma bir sorun ise, üç olası sorun giderme adımları vardır. Bir örnek-line Backflush gerçekleştirin. 2. Yoğunluğu azaltmak için protoplast süspansiyon sulandırınız. 3. Protoplast çözümü, santrifüj ve tabanda sonra filtrasyon adım (3.3) tekrar temizleyin.
5. 488 nm lazer GFP ve 610/20 nm eksitasyon sonra kızıl spektrumu otofloresansı (RSA) 530/30 nm'de forward scatter (FSC), yan dağılım (SSC) ve emisyon ölçümü için cihazın hazırlayın. Bunlar özünde GFP pozitif protoplast izole etmek için kullanılan parametrelerdir. Burada voltaj ayarları aşağıdaki gibidir: FSC - 60V, SSC 250V, GFP 350V ve RSA 335V. Not optimum voltaj ayarlarını her FACS için farklı olacaktır ve hatta hücre sıralayıcı ömür boyu ayarlanabilir gerekecektir.
6. Forward scatter karşı tarafında dağılım için dotplot kurarak başlayın. Ölçülen olayları komplo merkezli böylece voltaj ayarları uygulayın.
7. Sonra, karşı kırmızı yeşil floresan sinyallerin bir nokta arsa oluşturun. Wild-tip (non-GFP) protoplast süspansiyon bakarken ölçülen olayları komplo merkezli çapraz bir nüfus verim böylece voltaj ayarları uygulayın. GFP işaret çizgisine türetilmiş bir protoplast süspansiyon, wild-tip örnekleri görülen yeşil floresan olaylar asla net bir nüfus üretecektir.
8. GFP ve RSA arasındaki spektral örtüşme ayarlamak için tazminat kısıtlamaları ayarlayın. Uygun tazminat kısıtlama ayarlarını olmayan GFP protoplast ve enkaz GFP pozitif protoplast daha iyi ayrılması için izin verecektir. RSA, eksi 17,91% GFP: Burada kullanılan kısıtlamaları aşağıdaki gibidir.
9. Non-GFP protoplast bir negatif kontrol kapısı sınırları (Şekil 4) tanımlanmasında yardımcı olmak için kullanılması gereken GFP pozitif olayları tanımlamak için bir kapı ayarlayın.
10. Analiz küçük enkaz bırakmak için ileri bir dağılım kesme uygulayın. FSC vs SSC arsa GFP pozitif olaylar kesme yerleştirme belirlemenize yardımcı olmak için gözünüzde canlandırın. Burada, kesme 5.000 olarak belirlendi. FACS enkaz yüksek düzeyde tür olaylar ve bir örnek olarak enkaz sayacaktır unutmayın, beklenenden daha farklı bir yüzde GFP pozitif olayların olabilir. Bu bir sorun değildir. Ancak, daha fazla enkaz örnek, daha uzun sıralama alacak.
11. Deney ve analiz edilmesi gereken hücre tipine bolluğuna bağlı olarak, optimal verim veya optimal saflık sıralanmış hücreleri ya FACS hassasiyet modu ayarlayabilirsiniz.
12. RNA ekstraksiyonu için, uygun miktarda RNA ekstraksiyon tampon toplama tüpleri (1,5 ml mikrofuge'de tüpler) hazırlar. Bu kurulum, 20.000 sıralama olaylar ekstraksiyon tamponu 350 ul (RNeasy mikro kiti, QIAGEN) sıralanır yaklaşık 100 ul toplam hacmi verecektir. Sıralama tamamlanmasının ardından hücre süspansiyonu üst kısmındaki havuz gibi örnekleri karıştırın.
13. Örnekleri saklayın veya RNA ekstraksiyon doğrudan devam. Başarılı mikroarray analizleri olduğunca az 500 sıralanır olaylar çıkarılan RNA preformed olmuştur. Burada, RNeasy mikro ekstraksiyon kiti (QIAGEN), WT-Ovation Pico RNA Amplifikasyon Sistemi ve FL-Ovation cDNA Biotin Modülü V2 (NuGEN) kullanılır.

Temsilcisi Sonuçlar

Yaklaşık 1.500 bir hafta eski P _SCR Bir phytatray: 60.000 protoplast (hemasitometre tarafından ölçülen) hakkında GFP fide vermiştir. 65.000 FACS işlenmiş olaylar% 2.6 GFP-pozitif olarak tanımlanmıştır (Şekil 4b) sıralanır.

Yaklaşık 1.500 dört gün eski P _WOX5 sekiz tabak: GFP fideler her (toplam 12.000) 30.000.000 protoplast (hemasitometre tarafından ölçülen) hakkında vermiştir. 16.000.000 FACS işlenmiş olayların% 0.063 GFP-pozitif olarak tanımlandı ve sıralanır (Şekil 4c).

10.000 sıralanmış olaylar genelde RNA ekstraksiyonu için kullanılır ve 20 ile 140 ng toplam RNA (Şekil 5) verim alınabilir.

Şekil 1. Arabidopsis kök hücre tipine özgü GFP işaretleyici hatları. Floresan mikroskobu görüntüleri diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve Metamorph yazılımı (Moleküler Devices) üzerinde çalışan bir Eclipse 90i mikroskop (Nikon) GFP filtre ile çekildi. DIC ve GFP görüntülerin canlandırma amacı üst üste. Bu görsel deneyde kullanılan iki belirteç hatları gösterilir;a) P _SCR: GFP ve b) P _WOX5: GFP.

Şekil 2. Bitki büyüme koşulları. Fideler phytatrays (a) veya dikey konumlandırılmış agar plakları (b) hydroponically bir çevre denetleyicisi yetiştirilmiştir.

Şekil 3. Bitki protoplast GFP ifade Floresan mikroskobu görüntüleri diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve GFP Metamorph yazılımı (Moleküler Devices) üzerinde çalışan bir Eclipse 90i mikroskop (Nikon) bir filtre ile çekildi. DIC ve GFP görüntülerin canlandırma amacı üst üste. Oklar bir patlama hücre, hücre artıkları ve GFP pozitif protoplast göstermektedir. Iki beyaz çizgiler arasındaki mesafe 50 mikron.

Şekil 4. Floresan aktive GFP pozitif protoplast hücre sıralama vahşi tip (a) P _SCR türetilen protoplast:: GFP (b) veya P _WOX5: GFP (c) işaretleyici hatları bir FACSAria (BD) ile analiz ve sıralanmış tanımlanan kapıları kullanarak karşı kırmızı floresan (610/20 nm; y ekseni), yeşil (x ekseni 530 / 30 nm) bir dotplot. 100.000 olaylar her bir parsel sunulmaktadır. GFP ayırma kapısı giren olaylar yeşil vurgulanır.

Şekil 5. 10.000 sıralanmış hücrelerden Temsilcisi RNA ekstraksiyon Hücreler RNA ekstraksiyon tamponu (QIAGEN) doğrudan sıralaması, RNA saflaştırılmış ve 2100 Bioanalyzer (Agilent), konsantrasyon, saflık ve bütünlüğü için kontrol edildi . Hem işaretleyici hatları gösterildiği için üç çoğaltır.

Tartışmalar

Protoplast, prensip olarak, elverişli koşulları optimize RNA kalitesi ve miktarı büyük ölçüde artıracak, çeşitli bitki dokularında elde edilebilir. Protoplasting çözüm ve seçmeli inkübasyon tampon kullanılan her ikisi de bu yönünü etkileyecektir.

Birçok farklı floresan proteinleri kullanılan FACS yeteneklerine bağlı olarak, kullanılabilir, örneğin, GFP, RFP, YFP, CFP ya da birçok varyantları ve türevleri . Belirteçlerin ifade buradaki gibi sadece h?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 μm nylon mesh	Sefar Filtration	NITEX 03-250/50
100 μm nylon mesh	Sefar Filtration	NITEX 03-100/47
Square petri dishes	Fisher Scientific	08-757-10k
Phytatrays	Sigma-Aldrich	P1552
Murashige and Skoog Basal Medium (MS)	Sigma-Aldrich	M5519
sucrose	Fisher Scientific	S5-3
MES	Sigma-Aldrich	M2933
KOH	Sigma-Aldrich	P1767	10 M stock
Eclipse 90i microscope	Nikon Instruments
Cellulase R-10	Yakult Pharmaceutical
Macerozyme R-10	Yakult Pharmaceutical
D-mannitol	Sigma-Aldrich	M9546
KCl	Sigma-Aldrich	P8041	1 M stock
BSA	Sigma-Aldrich	A3912
β-mercapt–thanol	Calbiochem	444203
CaCl2	Sigma-Aldrich	C2536	1 M stock
orbital shaker	Labline Instruments
40 μm cell strainer	BD Biosciences	352340
conical 15 ml tubes	BD Biosciences	352196
table centrifuge	Sorvall, Thermo Scientific	Legend RT
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
FACSAria	BD Biosciences
1.5 ml microfuge tubes	VWR international	20170-38
RNeasy micro kit	Qiagen	74004
WT-Ovation Pico RNA Amplification System	NuGEN	3300_12
FL-Ovation cDNA Biotin Module V2	NuGEN	4200_12