KLRG1 tetramer Üretim için Protokol

Özet

Bu protokol KLRG1 ligandların analizi için güçlü bir araçtır KLRG1 tetramer, üretim açıklamaktadır.

Özet

Öldürücü hücre lektin-benzeri reseptör G1 (KLRG1) C tipi lektin-benzeri süperailesinin ait bir tip II transmembran glikoprotein inhibitör reseptör. KLRG1 bir monomer olarak ve bir disülfit bağlantılı homodimer olarak var. Bu iyi korunmuş reseptör, en olgun ve en yakın zamanda aktif NK hücreleri gibi efektör / bellek T hücrelerinin bir alt kümesi bulunur.

KLRG1 tetramer yanı sıra diğer yöntemleri kullanarak, E, K, ve R-cadherins KLRG1 ligandlar olarak tespit edilmiştir. Bu Ca ^{2 +} bağımlı hücre-hücre adezyon molekülleri, hücre-hücre etkileşimleri, bir transmembran bir etki alanı ve aktin hücre iskeletinin bağlı bir sitoplazmik etki alanı için sorumlu beş kaderin tekrarlar içeren bir ekstrasellüler etki oluşur.

KLRG1 tetramer Üretimi KLRG1 ligandlar belirlenmesi için gerekli idi. KLRG1 tetramer immün yanıt ve doku bütünlüğünü düzenleyen rolleri cadherin ve KLRG1 oyun aydınlatmak için de eşsiz bir araç.

Protokol

İçerme Organları Hazırlanması

1. TB 4 x 500 ml'lik şişeler İnokülasyon her bir gecede KLRG1 plazmid inşa ifade bakteri kültürü ile 50 mcg / ml carbenicillin ve kloramfenikol içeren. OD 600 nm dalga boyunda 0.6 Å ulaştığında, 37 ilavesi ile 0.4 M IPTG neden ve kültür sallayarak ek bir 4 saat inkübe ° C
2. Hasat edilen hücrelerin tabanda tampon pH = 8.0 (50 mM Tris-HCl,% 25 (W / V), sukroz, 1 mM EDTA, 10 mM DTT) süspanse edin. Not: Bu aşamada pelet dondurulabilir.
3. Polipropilen beher bakteriyel resuspensions en fazla 60 ml Havuzu. Gerekli TE tamponu, pH 8.0 ile 60 ml ayarlamak ve karışımı yarım hızda karıştırın.
4. Karışımı karıştırarak için açılan bilge ekleyin: lizozim (son = 1 mg / ml), MgCl2 (son = 5 mM), 2 mg DNAz Ben 75 mM NaCl, Triton-X100 (son =% 1), DTT (% 50 gliserol içerdiği son = 10 mM).
5. 1.5 dakika süreyle buz üzerinde çözüm sonikasyon ve 10 dakika için 5,000 RPM lizatları santrifüj 4 ° C
   1. Süpernatant Durusu.
   2. 15 ml yıkama tamponu pH = 8.0 (50 mM Tris-HCl,% 0.5 Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
   3. Pelet tamamen yeniden süspanse kadar buz üzerinde, 1.5 dakika için çözüm sonikasyon.
   4. 4 10 dakika için 5,000 RPM örnekleri Santrifüj ° C
   5. Yıkama 5 kez tekrarlayın.
6. TE Tampon 4 ml Triton X-100, santrifüj ve tekrar süspansiyon olmadan yıkama tamponu ile 5b tekrarlayın.
7. 30 ila 100 mg / ml konsantrasyonda ıslak ağırlık dahil organları bulamacı ve TE tampon mağaza alın.

KLRG1, Refolding

1. Tampon pH refolding 1 L = 8.0 (0.4 M Arginin-HCl, 0,1 M Tris pH 8-8,3, 2 mM EDTA, 0.2 mM PMSF, 3 EDTA-proteaz inhibitörü tablet, 5 mM GSH ve 0.5 mM GSSG) ve soğuk 4 ° C karıştırma iken.
2. Dahil organları katlama karışımın içine enjeksiyon için hazırlayın: protein konsantrasyonu son 2 3 mcM böylece her 5 10 0.25 0.5 mcM konsantrasyon ile enjeksiyon yapmak için idealdir.
   1. 7 M GnHCl dahil organları bulamaç 50 mg hacmi 10 mM β-mercaptoethanol eritin.
   2. Tutun 37 dahil organları / GnHCl karışımı ° C için 30 - 40 dakika ve vorteks her 5 dakikada tam bir erime sağlamak için (bulamaç tamamen erimiş olacak).
   3. 4 mikrosantrifüj 30 dakika maksimum hızda Santrifüj ° C ve 15 ml santrifüj tüpüne süpernatantı aktarın. Küçük siyahımsı pelet herhangi bir transfer değil.
3. Enjeksiyon tampon (3 M GnHCl, 10 mM NaAcetate pH 4.2,10 mM EDTA) ile ses seviyesini ayarlayın.
4. 1 ml seyreltilmiş dahil organları her saat enjekte edilir. Enjekte zaman, yüksek hızda karıştırın 2 saniye arasında her damla damla 1 ml seyreltilmiş dahil organları damla ekleyin. Enjeksiyonu yapıldığında, düşük hızda karıştırın.
5. 4 düşük hızda karıştırarak gecede Devam ° C

Refolding Reaksiyonlar konsantrasyonu

1. Millipore s protokolünü takiben, bir Amicon kullanarak önceden filtrelenmiş (0.22 mikron filtreli) refolding reaksiyon 1 L konsantre Hücre ve ~ 10 ml YM10 NMWL 10K ultrafiltrasyon membran (Millipore) Karıştırmalı.
2. ≤ 2 ml Konsantre bir Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).

KLRG1 tetramer saflaştırılması

1. 4 AKTAFPLC Kur ° C GE Healthcare kılavuzları göre.
2. Boyut dışlama kromatografisi ile bir Sephacryl S-200, 16/60, yüksek çözünürlüklü 20 mM HEPES sütun (GE Healthcare) ve 150 mM NaCl kullanarak KLRG1 monomer formu arındırın. (Bakınız Şekil 1).
3. Centriplus kullanarak 1 ml Konsantre YM-10 10K MWCO (Millipore).
4. KLRG1 monomer biotinylate Avidite s protokole göre Bira enzim kullanın.
5. Serbest biotin 2 boyut dışlama kromatografisi ile elimine edilir.
6. KLRG1 molekülü KLRG1 monomer 4 katlı molar aşırı PE konjuge streptavidin (BD Biosciences) ile karıştırılarak tetramerized.

Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 AKTA FPLC boyut dışlama kromatografisi. Temsilcisi olumlu sonuçlar KLRG1 refolded. Monomer ayırma (83,52 ml), dimer (56,36 ml) ve refolded KLRG1 multimer (36,26 ml) form grafiğini gösterir. 94,25 ml zirve tampon değişimi temsil eder.

Tartışmalar

Bu protokol, bu biotinylate arındırmak için nasıl gösterildiği ve tetramerize KLRG1. KLRG1 tetramer flow sitometri KLRG1 ligandlar etiketlemek için kullanılabilir. Refolding koşulları her protein için ampirik olarak test edilmesi olsa da, diğer C-tipi lektin benzer bir protokol kullanılarak tetramerized olabilir. Problar, C-tipi lektin reseptörleri yetim ligandlar olarak tetramerized proteinleri kullanarak potansiyel olarak tespit edilebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BirA Enzyme and Buffer	Biotinylation Kit	Avidity	BIRA500
Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free	Reagent	Roche Group	11 836 170 001	or equivalent
Amicon Stirred Cell	Equipment	EMD Millipore	Model #8400	or equivalent
YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane	Filtration Supply	EMD Millipore	13642
15 ml YM10 concentrator	Filtration Supply	EMD Millipore	4411
AKTAFPLC	Equipment	GE Healthcare	18-1900-26
Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column	Equipment	GE Healthcare	17-1166-01
Strepavidin PE	Reagent	BD Biosciences	554061	or equivalent