JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Erratum Notice
  • Özet
  • Özet
  • Protokol
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Erratum
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Özet

Görselleştirme In vivo RNA ulaşım floresan etiketli RNA transkript mikroenjeksiyon yapılır Xenopus Oosit, konfokal mikroskobu ile takip.

Özet

RNA lokalizasyonu hücre polarite kurulması korunmuş bir mekanizma. Vg1 mRNA Xenopus laevis oosit ve mekansal Vg1 protein gen ekspresyonu kısıtlamak için eylemler bitkisel direğe lokalize. Bu şekilde dağılımı Vg1 sıkı kontrol gelişmekte olan embriyonun uygun germ tabakası belirtimi için gereklidir. MRNA 3 'UTR RNA dizisi elemanları, Vg1 yerelleştirme elemanı (VLE) gerekli ve doğrudan ulaşım için yeterli. In vivo Vg1 mRNA tanıma ve taşıma çalışma için, basit bir görsel okuma ile trans-faktör yönelik taşıma mekanizmalarının kapsamlı analizini sağlayan bir görüntüleme tekniği geliştirdiler.

RNA yerelleştirme görselleştirmek için, floresan etiketli VLE RNA sentez ve bireysel oosit bu transkript microinject. Enjekte edilen RNA taşıma izin oosit kültürü sonra oosit konfokal mikroskobu ile görüntüleme için önce sabit ve kurutulmuş. MRNA yerelleştirme desen Görselleştirme RNA ulaşım tam yol izlenmesi ve cis etkili VLE (Lewis ve ark, 2008 bağlamak transkript ve trans-etkili faktörler içinde unsurları, RNA ulaşım yönlendirmede rolleri tanımlamak için bir okunmasını sağlar Messitt ve ark, 2008). Biz ek RNA ve proteinler (Gagnon ve Mowry, 2009, Messitt ve ark, 2008) ile eş-yerelleştirme yoluyla bu tekniği var ve motor protein ve hücre iskeletinin bozulması ile birlikte prob (Messitt ve ark, 2008) mRNA yerelleştirme altında yatan mekanizmalar.

Protokol

Bölüm 1: floresan ile işaretlenmiş mRNA Transkripsiyon.

  1. Plazmid DNA, RNA yerelleştirme elemanı ya da ilgili diğer dizisi içeren Linearize ve 1 mcg / ml DEPC tedavi H 2 O. ile tekrar süspansiyon DNA şablonu T7, SP6 veya T3 RNA polimeraz tarafından transkripsiyon için upstream organizatörü sitelerine sahip olması gerekir.
  2. 1.5mL steril bir tüpe aşağıdaki reaktifler ekleyin:
    a. 10X Tx tampon (M & M) 2 ul
    b. 20X kapak / NTP mix (M & M) 1 ul
    c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen) 1 ul
    d. UTP, [α-32 P] (1 μCi / ml) (Perkin Elmer) 1 ul
    e. DEPC-H 2 O 11 ul
    f. 0.2 M DTT 1 ul
    g. RNasin (Promega) 1 ul
    h. doğrusal DNA 1 ul
    i. RNA Polimeraz (Promega) 1 ul
  3. Reaktifler hafifçe karıştırın ve kısaca santrifüj (10 sn. Mikrosantrifüj).
  4. Tüp fluorofor, photobleaching önlemek için alüminyum folyo ile kaplama, 37 ° C'de 2-4 saat inkübe.
  5. DNA aşağılamak için 1 ul 1 mg / ml RNaz ücretsiz DNaz (Promega) ekleyin.
  6. 37 az 15 dakika inkübe ° C
  7. Reaksiyonu durdurmak için 79 ul 20 mM EDTA (pH 8.0) ekleyin.
  8. "Giriş" ve kaydetmek olarak etiketlenmiş ayrı bir tüp, 1 ul çıkarın.
  9. 1 ml G50 sütun üzerinden tam uzunlukta mRNA hariç adi nükleotid içerecektir Spin reaksiyonu (Gereç ve Yöntem).
  10. RNA etanol yağış Konsantre:
    1. 250 ul% 100 etanol, 10 ul 7M CH 3 COONH 4, 1 ul taşıyıcı RNA (maya tRNA, 10 mcg / ml) veya 1 ul glikojen (20 mg / ml) ekleyin.
    2. İyice karıştırın ve katı kadar donma -80 ° C> 30 dakika veya 15 dakika boyunca kuru buz üzerinde.
    3. 15 dakika, süzün süpernatant mikrosantrifüj maksimum hızda dönerler.
    4. 150 ul% 75 etanol ile yıkayın.
    5. Mikrosantrifüj, süzün süpernatant maksimum hızda 3 dakika Spin.
    6. Tüm etanol buharlaştı sağlamak, 3 dakika boyunca 37 ° ° C pelet kurulayın.
  11. 11 ul DEPC-H 2 O süspanse edin ve "anonim" olarak etiketli ayrı bir tüp, 1 ul kaldırmak.
  12. Yüzde dahil belirleyin ve 50 nm RNA sulandırmak (Malzeme ve Hesaplama Yöntemleri bakınız).
  13. Donma / çözülme döngüleri önlemek için tek kullanımlık, RNA 5 ul alikotları dondurulmuş ve -80 ° C'de birkaç hafta saklanabilir.

Bölüm 2: Mikroenjeksiyon için hazırlanıyor.

  1. RNA Hazırlanışı:
    RNA (50 nM) bir kısım çözülme ve RNA denatüre 70 ° C, 3-5 dakika. Herhangi bir parçacık kaldırmak ve buz üzerinde tutmak için, oda sıcaklığında mikrosantrifüj maksimum hız 10 dakika boyunca dönerler.
  2. Oosit Hazırlanışı:
    1. Cerrahi Xenopus laevis kadın (Nasco) yumurtalık çıkarın.
    2. 25 ml kollajenaz çözüm içeren 50 ml konik bir tüp içine Xenopus laevis yumurtalık Trim parçaları (Gereç ve Yöntem) .
    3. 18 ° C'de 15 dakika süreyle hafifçe sallayın ya da oosit kadar gözle görülür bir şekilde yumurtalıktan ayrılır. Parti değişimi için toplu iş nedeniyle, kollajenaz tedavi süresi değişebilir ve defoliculation sağlamak için görsel olarak dikkatle izlenmelidir.
    4. Oosit tüp yerleşmek için izin verin, çözüm kaldırmak ve (Gereç ve Yöntem) MBSH tamponu ile oosit yıkayın.
    5. Üç yıkama olmak üzere toplam iki kez daha tekrarlayın yıkayın. Bu oosit izolasyon protokolü Cohen ve ark, 2009 yılında bu detaylı benzer.
    6. MBSH tampon standart bir diseksiyon mikroskobu altında elle tür evre III / IV oosit (Dumont, 1972). Evre IV oosit pigment ile biraz daha büyük ve benekli ise Evre III oosit, tamamen opak ancak beyaz. Biraz şeffaf Oosit tam pigmentli veya sergi polarize pigment dağılımı çok eski olduğunu, çok genç ve oosit.
  3. İğne Hazırlanışı:
    ~ 0.05 mm dış çapı iğne çekin ve konik. (Drummond Bilimsel 3.5 inç kılcal damarlar (sipariş # 3-000-203-G / X), bir Sutter Instrument Co mikropipet çektirmesi ve TEFE Inc beveller.)

Bölüm 3: Mikroenjeksiyon

  1. DEPC-H 2 O ile iğne enjeksiyon başına 2 nl sunmak için kalibre edin. Biz önden bir gaz tahrik mikroenjektör (Gereç ve Yöntem) kullanarak bizim iğne yükü, ve bir mikrometre kullanarak damla boyutu kalibre.
  2. RNA iğne içine yükleyin.
  3. Oosit sıralaması MBSH tampon içeren bir enjeksiyon çanak içine yerleştirin. Biz siyah köpük kauçuk tabakası ile bir çanak microinject. Soluk oosit beyaz bir backgrou iyi öne çıkıyornd.
  4. 50 nM RNA 2 nl ile her oosit dikkatlice enjekte edilir.
  5. RNA DEPC-H 2 O ile durulama, iğne ve enjeksiyon için bir sonraki RNA yüklemek boşaltınız .

Bölüm 4: Oosit Kültür

  1. Oosit iyi steril bir 24 plaka (Sigma Aldrich) yerleştirin. Biz de başına bin oosit kültürü.
  2. Tamponu çıkarın ve 400 ul O ocyte C ulture M edium ile değiştirin (OCM, Gereç ve Yöntem) ortalama. Kültür plakasına sırasında nemli bir ortam kültürü korumak için ıslak kağıt havlu ile hava geçirmez bir plastik kap içine yerleştirin.
  3. 18 ° C, 8 ve 48 saat arasında değişen zaman noktaları için oosit inkübe edin.

Bölüm 5: Oosit Fixation, Dehidrasyon ve Depolama

  1. Ölü oosit Sıralama ve cam şişe hayatta oosit. Biz rutin olarak>% 90 hayatta kalma gözlemlemek.
  2. MEMFA fiksatif (Gereç ve Yöntem) ve 20 dakika boyunca kaya yerleştirin oosit. Oosit, alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun.
  3. Fiksatif çıkarılması ve MBSH tampon eşit hacmi değiştirilmesi oosit yıkayın. Toplam iki yıkar bir yıkama için bir kez daha tekrarlayın.
  4. Susuz metanol içine oosit Yıkama:
    1. Hacminin yarısını çıkarın, metanol ile değiştirin.
    2. "" Iki kez adım tekrarlayın.
    3. Çözüm çıkarın, metanol ile değiştirin.
    4. Metanol yıkama tekrarlayın.
  5. Oosit resme hazır kadar -20 ° C'de saklanabilir.

Bölüm 6: Konfokal Mikroskopi Görüntüleme RNA Yerelleştirme

  1. Görüntüleme önce, görüntüleme yüzeyini kaplayan cam bir alt FluoroDish (TEFE A.Ş.) Murray Takas Orta (02:01 benzil benzoat-benzil alkol) ekleyin.
  2. Dikkatle transfer metanol hacmi en aza indirerek, metanol FluoroDish oosit transfer.
  3. Ters bir konfokal mikroskop Görüntü (Biz başarıyla Zeiss LSM510 ve Leica TCS SP2).

figure-protocol-6705
Şekil 1: floresan Etiketli Transkriptler Mikroenjeksiyon Subselüler RNA Yerelleştirme Görselleştirme Alexa Fluor 546 etiketli A. takiben mikroenjeksiyon, RNA ilk çekirdeğini sınırlıdır B. kültür sekiz saat sonra, bir floresan etiketli kontrolü RNA eşit şekilde görüleceği oosit sitoplazmasında dağıtılan C. Ancak, taşıma makine işe dizileri içeren floresan etiketli RNA oosit (dibe doğru) bitkisel direğe hücre içi lokalizasyonu sürecinde olabilir. Ölçek çubuğu = 50 mm.

Tartışmalar

Burada Xenopus oositleri mRNA yerelleştirme görselleştirmek için bir protokol var. Bu yöntem, floresan etiketli RNA transkript kullanarak önceden digoxigenin etiketli transkript ile elde edilen ve in-situ temelli yaklaşımlar (Mowry Melton, 1992, Gautreau ve ark, 1997) daha basit ve daha hızlı daha yüksek sinyal gürültü oranına sahiptir. Bu yöntemi kullanarak, mühendis dizisi mutasyonlar RNA ve hızlı bir şekilde in vivo fonksiyon testi. Ayrıca, ek Alexa UTP fluorophores kullanarak, ...

Açıklamalar

Brown Üniversitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak laboratuvar hayvanlarında kullanılarak yapılan deneyler yapıldı.

Teşekkürler

RNA lokalizasyonuna KLM NIH (R01GM071049) bir hibe ile desteklenmektedir.

Malzemeler

10X Tx tampon

  • 60 mM MgCl 2
  • 400 mM Tris-HCl (pH 7.5)
  • 20 mM spermidin-HCl

20x kapak / NTP karışımı

  • 10 mM CTP
  • 10 mM ATP
  • 9 mM UTP
  • 2 mM GTP
  • 20 mM G (ppp) G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 sütun

  • Hidrat 5 ml 100 g Sephadex G-50 boncuk (Sigma Aldrich) H 2 O. deiyonize 30 dakika DEPC davranın. ve otoklav. Eksik stok oda sıcaklığında saklayın. Kullanmadan önce, aşağıdaki RNaz ücretsiz çözümleri ekleyin:
  • 0.5 ml 0.2 M EDTA
  • 1 ml 1 M Tris pH: 8.0
  • 0.5 ml% 20 SDS
  • 4 ° C'de tam G-50 çözüm saklayın
  • Çıkartın ve atın piston 3 ml şırınga (BD Biosciences) ve 15 ml konik tüp (Corning) içine şırınga varil. Cam yünü (bir kuruş yarısı boyutu hakkında bir eklenti) küçük bir miktarı ile şırınga takın.
  • Boncuklar tekrar süspansiyon çalkalanarak tam G-50 çözüm.
  • Boş sütun için 2 ml G-50 çözüm ekleyin.
  • 1 dakika için 1.000 x g benchtop santrifüj Spin.
  • 200 ul DEPC tedavi deiyonize H 2 O, her bir sütun ekleyin. Spin.
  • Üç yıkama olmak üzere toplam iki kez daha tekrarlayın yıkayın.
  • Yeni bir 15 ml konik tüp şırınga varil çıkarın.

Kollajenaz çözüm

  • Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 75 mg kollajenaz
  • 25 ml 0.1 M KPO 3 + (pH 7.4)

MBSH tampon

  • 88 mM NaCl
  • 1 mM KCl
  • 2.4 mM NaHCO 3
  • 0.82 mM MgSO 4 X 2 O 7H
  • 0.33 mM Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O
  • 0.41 mM CaCl 2 X 6H 2 O
  • 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oosit Kültür Orta

  • % 50 L15 orta
  • 15 mM HEPES (pH 7.6)
  • 1 mg / ml insülin
  • 100 mg / ml gentamisin
  • 50 U / ml nistatin
  • 50 U / ml penisilin
  • 50 mg / ml streptomisin

MEMFA çözümü

  • 0.1 M MOPS (pH 7.4)
  • 2 mM EGTA
  • 1 mM MgSO 4
  • % 3.7 formaldehit

Bilgisayar RNA verimi

  • "Giriş" ve standart bir sintilasyon sayacı kullanarak "anonim" örneklerini BGBM belirleyin.
  • dahil = ("dahil") / (10 x "giriş")
  • Tipik kuruluş değerleri ~ 0.03 ve 0.10 arasında değişmektedir.
  • Farklı polimerazları için maksimum teorik verir:
    T3, T7, SP6 - 2.64 mg
  • Reaksiyon verimi mg = (maksimum verim polimeraz kullanılır) X (dahil)
  • Sulandırınız RNA 50 nM = (mikrogram RNA) / 320 / (üsleri RNA uzunluğu) / (5x10 -8)
  • Reaksiyon genellikle verimi ~ 50 nM RNA 50-100 ul.

Referanslar

  1. Cohen, S., Au, S., Pant, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. JoVE. 24, (2009).
  2. Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J. Morphol. 136, 153-179 (1972).
  3. Gagnon, J. A., Mowry, K. L. RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs. Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).
  4. Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes. Development. 124, 5013-5020 (1997).
  5. Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes. Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).
  6. Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes. Dev Cell. 15, 426-436 (2008).
  7. Mowry, K. L., Melton, D. A. Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes. Science. 255, 991-994 (1992).
  8. Yoon, Y. J., Mowry, K. L. Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin. Development. 131, 3035-3045 (2004).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes
Posted by JoVE Editors on 6/10/2011. Citeable Link.

null

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 35RNAGeli imsel BiyolojiMikroenjeksiyonRNA Yerelle tirmeXenopusoositVLE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır