Geç Stage Drosophila pupa Brain İlköğretim Nöronal Kültürler

Özet

Bu video, geç dönem Drosophila pupa beyinleri primer nöronal kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor. Canlı kültürlerin Görüntüleme Fura-2 kullanarak kalsiyum düzeyleri neurite akıbet ve görüntüleme göstermektedir.

Özet

Bu video, geç dönem Drosophila pupa beyinleri primer nöronal kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor. Prosedür puparium oluşumundan sonra 70-78 saat hayvanların beyinlerinin kaldırılması ile başlar. Izole beyinleri serum büyüme ortamında birkaç yıkar takip papain kısa inkübasyondan sonra gösterilmiştir. Bir lamel medya 5 ul açılan her bir beyin mekanik ayrılma süreci gösterilmektedir. Post-mitotik nöronların akson ve dendritler disosiasyon sırasında soma yakın sheered ama nöronlar kaplama bir kaç saat içinde süreçleri yeniden başlar. Görüntüler 2 gün canlı kültürler göstermektedir. Nöronlar kültüründe ilk haftasında süreçlerini ayrıntılı olarak devam etmektedir. Spesifik nöronal nüfus, kültür, GFP veya RFP floresan belirteçleri doku belirli bir ifade sürücü GAL4 hatları kullanarak tespit edilebilir. Tüm hücre kayıtları kültürlü nöronların fonksiyonel, kendiliğinden aktif ve GABAerjik kolinerjik sinaps oluşturur göstermiştir. Kısa bir video segment, kültürlü nöronların bir tabak içinde kendiliğinden kalsiyum transientler ve nikotin uyarılmış kalsiyum tepkileri izlemek için bir kalsiyum gösterge boyası olarak Fura-2 kullanarak kültürlü nöronlarda kalsiyum dinamiklerini göstermektedir. Bunlar pupa beyin kültürleri, genetik ve farmakolojik araçları merkezi sinaps oluşumu ve fonksiyonunu etkileyen iç ve dış faktörleri tanımlamak için kullanılabilecek yararlı bir model sistem.

Protokol

Kültür gün önce hazırlıklar:

1. Steril diseksiyon çözüm olun.
2. Steril DMEM olun ve 10 ml alikotları tutmak, 4 ° C 2 hafta boyunca.
3. 1 ay için 50 veya 100 ul alikotları steril DDM2 takviyeleri ve donma olun.
4. CONA / laminin olun.
5. Kat lamelleri.
   İsteğe Bağlı: 4 ay kadar donmuş steril Cnbm ve mağaza olun.

Kültür, günü

I. laminer akış kaput Enzim Çözümü (ES) hazırlayın

1. 5 ml, 15 ml santrifüj tüpüne çözüm diseksiyon (DS) koyun.
2. 0.6 ml Eppendorf 0.8 mg L-Sistein tartılır ve DS 150 ul ekleyin. Kristaller gidene dek, yukarı ve aşağı Pipet.
3. 150 ml 5 ml DS DS / Sistein ekleyin ve iyice karıştırın.
4. 50 U Papain (adet) ekleyin.
5. 7 ml 0.1 N Na OH ekleyin ve iyice karıştırın. Çözüm 30 dakika içinde açık olacak. aktive edildiğinde.
6. 0,2 mm steril 1,5 ml vidalı kapaklı mikrofuge'de tüp içine şırınga filtresi ile filtre enzim çözeltisi
   
   Papain: 5 ml DS 50 U Wanna. Her parti, biraz farklı, bu yüzden ne kadar hesaplamak gerekir:
   37.3 mg / ml ve 28.3 U / mg
   37.3 x 28.3 = 1055,59 U / ml (1000 ml)
   50 U = 47.4 ml
   

II. DDM2 medya yapın

Kültür, günü: DDM2 yapmak için aşağıdaki takviyeleri eklemek

Için 10 ml DMEM, sadece kültür önce takviyeleri ekleyin:

1. 100μl Transferrin
2. 100μl Putrescine
3. 100μl Selenyum
4. 100μl Progesteron
5. 50μl İnsülin
6. 10μl 20-Hydroxyecdysone

Not: planlanan tüm kültürlerde (her beyin ayrı bir 35 mm Petri kabında tek bir lamel, medya 1.5 ms / kültür kaplama) için yeterli DDM2 olun

Adım III-VI yapılan steril olmayan bir laboratuvar tezgahı ve 45 dakika veya daha kısa sürede tamamlanması gerekmektedir.

III. Pupa Koleksiyonu

1. Diseksiyon mikroskop altında 10-15 flakon taraftan pupa seçin.
2. Pupa, kuru bir 35 mm Petri kabında kapak yerleştirin.

Not: Biz genellikle puparium formasyonu (APF) sonra 55-78 saat arasında pupa beyinlerini kullanmak. Neurite akıbet genel düzeyi en eski pupa biraz daha düşük iken baş kapsül, yıkılmaya yüz çünkü genç pupa beyin incelemek için biraz zordur. Canton-S wild tip gerginlik, bu aşamalar, hafif hafif kırmızımsı kahverengi pigmentli gözlerinden başka bir yerde çok az pigment ile tanınır.

IV. Diseksiyon mikroskobu altında Decapitation

1. Yeri sonraki iki damla steril diseksiyon çözüm Petri kabı kapağı, pupa.
2. Yavaşça sol elinde ince forseps ile tek bir pupa tutun ve ön pupa sonunda manikür kaldırmak için sağ elinde bir 1 cc şırınga, 27 gauge bir şırınga iğne kullanın.
3. Forseps ile pupa hafifçe sıkın ve baş çıktığında boyun koparmak için 27 gauge iğne kullanınız.
4. Iğne ucu veya forseps ile çözüm diseksiyon bırak baş aktarın.
5. 10-15 baş tek bir damla kadar tekrarlayın.

Diseksiyon mikroskobu altında kafa beyin V. Kaldırma

1. Her el, 27 gauge iğne ile 1 cc şırınga tutun.
2. Burnumun siz ve başın dorsal yüzeyi kuzeye bakacak şekilde çözüm diseksiyon açılan sinek kafa pozisyonu kullanın.
3. Baş aşağı pin ve ventral dorsal yüzeyine gider sağ gözünde bir yarık yapma hakkını saklı iğne kullanmak için burnumun içine sol iğne yerleştirin.
4. Burnumun bölgede sol yanında doğru bir iğne takın ve sonra beynin sağ gözü yarık doğru iterek manikür, sol gözün üzerine hafifçe bastırmak için sol iğne kullanınız. Genellikle optik lo hem beyin, nispeten bozulmamış, sağda yarık ortaya gerektiğinibes de hala bağlı ve bazen pigmentli göz dokusu.
5. Beyin, yeni bir steril, 35 mm Petri kabı, steril diseksiyon serum fizyolojik damla iğne ve transfer sırtına doğru itin.
6. Her genotip için 10-15 beyinleri toplayın.
   

VI. Kaldırılması, optik loblar ve enzim tedavisi

1. 27 gauge iğne ile 1 cc şırınga tutun ve her elin tüm beyinleri diseksiyon çözüm açılan küçük bir alanda toplamak için bu
2. Böylece her bir beyin doku kültürü kalan merkezi beyin bölgesi optik loblar kaldırmak için kesici aletler şırınga kullanın.
3. 5 ul 20 ul Pipetman, Eppendorf tüpüne 1 ml steril papain çözüm içeren tek bir genotip tüm beyinleri aktarmak için kullanın.
4. Brain için papain 60 devirde bir rotator seti 10-15 dakika inkübe edildi.
5. 3000 rpm'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin.
   

Steril laminer akış kaputu İçinde tüm adımları doku havaya maruz kalan adımları için laminer akış kaput yapılmalıdır.

VII. Yıkama

1. Enzim çözeltisi çıkarın ve steril diseksiyon çözümü ile değiştirin.
2. 3000 rpm'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin.
3. Steril diseksiyon çözümü ile bir toplam 3 kez yıkayın.
4. Diseksiyon salin çıkarın ve DDM2 ile değiştirin.
5. Santrifüj ve DDM2 ile toplam 2 kez yıkayın.
6. Steril bir 35 mm Petri kabında Transfer beyin ve medya.
   

VIII. Diseksiyon mikroskobu altında ezerek toz haline getirme ve Kaplama

1. DDM2 bir lamel merkezinde 5 ul yerleştirin.
2. Sarı bir ucu ile DDM2 Bu düşüşün 1 beyin aktarın.
3. Mikroskop altında beyin zar kadar küçük parçalar halinde (<1 dakikada almalıdır), 27 gauge iğne kullanın.
4. Görsel rehberliği altında, büyük parçalar pipetlemeyin ucu içine yavaşça emilir ve ortama geri sınırdışı böylece iyi bir noktaya çekti damlalıklı cam ucunu kırmak. Biz 100 ul hematokrit kapiller cam ile standart olarak gelir ağız emme boruları kullanın.
   
   Not: medya kabarcıkları almak için özen ve kullanmak için en iyi boyutu pipetlemeyin ampirik olarak belirlemek gerekir. İyi olanlar, yaklaşık 30 saniye / beyin, bazı bireysel hücrelerin ve hala bazı büyük öbekler beyin ayırmak izin verir. Yüksek güçte bu baktığınızda, nöronların yaklaşık% 10-20 hala kalan bazı işlemler var ve hala bazı büyük öbekler olacak. Çok ayrıştırmaları varsa, o zaman tüm hücreleri yuvarlak olacak ve onlar hayatta olmaz bu kadar zarar görmüş olacak. Bu adım, uygulama alır ve hızlı bir şekilde değiştirebilirsiniz büyük bir yüzey-hacim oranı ve DDM2 açılan osmolalitesi ve pH olmadığından hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Doku, mümkün olduğunca çabuk _CO 2 inkübatör yerleştirilmesi gerekiyor .
   
   
5. "Genotip, tarih ve saat": petri kapak yaz.
6. , 100 mm petri, 35 mm petri (ıslak kimwipe) koyun ve 30 dakika _CO 2 inkübatör yerleşmek izin .
7. DDM2 1.5 ml 35 mm tabak Sel.
8. % 5 CO ₂ inkübatör (23 ° C) inkübatör kültürleri tutun.
   
   Not: Eğer bir soğutma CO ₂ inkübatör erişim yoksa, standart bir memeli doku kültürü inkübatör kullanımı ve serin bir odada ve ısı 23 ya koymak ° C veya laboratuarda koymak, geçici kapatmak ve kullanmak kuluçka altındaki ortam etrafında düzenleyen geçici bir tepsi buz.
   

IX. Besleme Hücreler

1. CNBM/B27: 1 Gün (ertesi gün), 03:01 DDM2 yapmak CNBM/B27 0.5 ml (Şartlandırılmış Medya) eklemek.
2. CNBM/B27: Günlük 5 03:01 DDM2 için 1 ml medya değiştirin.
3. CNBM/B27 her 4-5 gün: 03:01 DDM2 besleyen hücrelerin tutun.
   
   Not: Kültürleri nöronal olmayan klimalı medya olmadan yetiştirilir ama nöronlar biraz daha kırılgan görünür ve elektrofizyoloji deneylerde kullanılmak için daha zor olabilir.

Tartışmalar

Neurites uzatmak ve fonksiyonel sinaptik bağlantıları oluşturmak embriyonik / postnatal kemirgenler beyinleri hasat nöronlar primer hücre kültürü yetiştirilebilir. Bu kültürlerin hazırlanması için Yöntemleri iyi kurulmuş ve kemirgen nöronal kültürlerin çalışmalar, sinaps oluşumu ve işlevi düzenlenmesi (Banker ve Goslin, 1991) yer alan genler ve çevresel faktörlerin belirlenmesi kritik bir rol oynamıştır. Türlerin çeşitli böcek nöron kültüründe yetişen olabilir, fonksiyonel kültür sinaptik bağlantı...

Malzemeler