Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Özet

Burada, fare Kapkaççı lökosit homing çalışmada non-invaziv bir iki foton (2P) mikroskopi yaklaşımı açıklar. Biz, bizim doku görüntüleme hazırlık teknik yönlerini tartışmak ve yürütme ve veri toplama için kurulmuş ilk tipik bir deney yoluyla okuyucu yürümek.

Özet

İki foton (2P) mikroskobu, yüksek çözünürlüklü bir görüntüleme tekniği geniş biyologlar tarafından adapte edilmiştir. 2P mikroskopi değeri dokulara içinde ve canlı farelerde hücre davranışları ile ilgili zengin Spatiotemporal bilgi sağlar. Lökosit işe host enfeksiyona karşı savunma ve ne zaman kontrolsüz önemli bir rol oynar, inflamatuar ve otoimmün hastalıklar için katkıda bulunabilir. Hücreler, ışık saçılması dokular içinde derin bulunan gemiler içinde hızla hareket ediyor bu yana, in vivo olarak lökosit işe incelenmesi teknik olarak çok zordur. Bugüne kadar, en intravital görüntüleme çalışmaları, kan damarları ve dokuların ortaya çıkarmak için cerrahi hazırlık gerektirir. Cerrahi kendisi tarafından indüklenen doku hasarı ve inflamasyon önlemek için, burada, biz fare Kapkaççı ve bilek lökosit ticaretini incelemek için kullanılabilecek bir tek hücreli non-invaziv görüntüleme yaklaşımı tanımlar. Biz, bizim 2P görüntüleme hazırlık teknik yönlerini tartışmak ve yürütme ve veri toplama için kurulmuş ilk tipik bir deney yoluyla okuyucu yürümek.

Protokol

1. Hayvan hazırlanması:

Bu protokol, nötrofil ve makrofajların floresan eGFP ¹ ifadesi etiketli olan yetişkin dişi yetişkin LYSM eGFP fareler kullanır.

1. Kan damarlarının Etiketleme:
   (655nm) 100 ul PBS olmayan hedefli kuantum noktaları 15μl kan damarları, görselleştirmek için seyreltilir ve görüntüleme önce fare 10-30 dakika içinde intravenöz olarak enjekte edilir.
2. Anestezi:
   1. Veteriner inhalasyon anestezi sistemi (Noble Sağlık Hizmetleri A.Ş.) indüksiyon odasında fare yerleştirin.
   2. Buharlaştırıcı İsofluranın% 3-4 ve% 100 oksijen taşıyıcı gaz akış hızı ayarlayın ~ 1 L / dk. Arka ayak tutam refleks kaybı kadar yanlışlıkla anestezi doz aşımı önlemek için, hayvan yakından izlemek.
   3. Anestezi 1.5 muhafaza görüntüleme sırasında gerektiğinde solunum bozulmaları en aza indirmek için ayarlanmış ~ 2% İsofluranın ve ince. Farenin solunum hızı, anestezi yeterli bir düzlemde sigortalamak için görüntüleme oturum boyunca dikkatle izlenmelidir.
   4. Puralube veteriner merhem gözlerin kurumasını önlemek için uygulanır.
   5. Fare düzenlenmiş 36 yerleştirilir ° C ısıtma yastığı (Braintree Bilimsel) enjeksiyonları ve görüntüleme sırasında ve hipotermi önlemek için.
   6. Dehidratasyonu önlemek için, fare 100 ul PBS sc her 1-2 saatte bir verilir.
3. Inflamatuar bir uyarana teslim lökosit işe ikna etmek için:
   1. Cerrahi evre ve% 70 etanol ile Kapkaççı çubukla fare yerleştirin.
   2. Insülin şırınga, iğne, enjeksiyon teslim derinliği hassas kolaylaştırmak ve geliştirmek için ~ 90 derece eğim yakın bir bükün.
   3. 1μl PBS içinde seyreltilmesi bioparticles E.coli 0.5 mg şırınga yükleyin. Bu kolay damlacık yük yapmak mikrofuge'de tüp kapağı yapılabilir.
   4. Kavisli bir forseps ile parmak tutun ve derinin hemen altına kadar eğim yukarı bakacak şekilde iğne ile deri yoluyla yavaşça yerleştirin.
   5. Yavaş yavaş enjekte edilir ve herhangi bir geri boşaltma önlemek için 5 saniye boyunca basılı tutun.

2. Görüntüleme sahne kurulumu:

Görüntüleme platformu merkezi üzerinden kesilerek yuvarlak bir delik olan bir alüminyum levha oluşur. Büyük bir kapak cam plaka ve lastik bir O-ring, arka pençe karşılamak için sıvı geçirmez bir gömme odasının oluşturmak için üstüne yapıştırılmış altına yapıştırılmış. 36 ° C plaka üstüne bağlanmış iki ısıtma elemanları ile alüminyum levha ısıtılır.

1. Önceden ısıtılmış görüntüleme sahnede fare koyun ve 36 ° C ısıtıcı kullanarak farenin çekirdek vücut ısısını korumak.
2. Superglue ince bir film tabakası ile görüntüleme odasının coverglass pençe sabitleyin.
3. Tutkal iki defa herhangi bir kayan bit kaldırmak ve daha sonra odanın taze PBS (36 ° C önceden ısıtılmış) ile doldurmak için pençe yıkayın.

Fare hayvan canlılığı oluşturan 4 saate kadar görüntülenebilir. Ayak yavaşça küçük miktarda aseton ve uzunlamasına görüntüleme çalışmaları için yeniden canlandı fareler ile serbest bırakılabilir. Ancak, bu durumda, biz görüntüleme süresi <2 saat tavsiye ve anestezi doz aşımı ya da dehidratasyon riskini en aza indirmek için oturumlar arasında 24-48 saat bekliyor.

3. Imaging Acquisition

Bu protokolde kullanılan iki foton mikroskobu (2P mikroskop) dik bir mikroskop oluşan özel bir dahili video hızı dual lazer sistemi. Sistem iki Ti ile donatılmıştır: Sapphire lazerler, dört baş-3 ve 4 kanal aynı anda satın almalar ve 20x suya daldırma hedefi (Olympus, 20x/0.95 NA) Bi-alkali Proje Yönetim Ekipleri.

1. 890-900nm safir lazer (Tutarlı A.Ş.): Chameleon XR Ti ayarlayın.
2. , Mavi (<480 nm, ikinci harmonik üretimi sinyali), yeşil (480-560nm, LYSM eGFP pozitif nötrofil) ve kırmızı (> 560 nm, kuantum nokta etiketli kan damarlarının üç kanal ayrı 480nm ve 560nm dikroik aynalar (SemRoc) kullanın. .) Alternatif olarak, 560nm filtre E. ayırt etmek için bir 570nm filtre ile değiştirilebilir 655nm kuantum noktaları (kırmızı derin görünür) coli bioparticles (576nm bioparticles turuncu görünecektir).
3. PBS içine dikkatlice amacı alt ve ayak bir gemi odaklanmak.
4. Görüntü elde etme hızı, video-oranı (30f/sec) işletme ve kollajen doku işareti olarak, hızlı bir şekilde ilgi (tek bir kan damarı bulmak için (video oranının toplama hızı) doku anket kaynaklanan ikinci harmonik sinyali kullanılarak ile görünür LYSM eGFP nötrofiller).
5. Proje Yönetim Ekipleri (renk ayrımı optimize etmek ve arka plan üzerinde yeterli sinyal elde etmek için gerekli lazer miktarını en aza indirmek için kazanç ayarlayın.dikkatli bir görüntü doyurmak için değil!).
6. Çıkarlarının alan bölgede bulunan sonra, zaman atlamalı görüntüleme başlar. Time-lapse görüntüleme, iki farklı zamansal çözünürlükleri ile yapılabilir. , Görüntüleme hücre yuvarlanma ve yapışma için ve kan damarları içinde gerçek zamanlı olarak, tek bir z-düzlemi 30f/sec kazanmak. Parankim hücre ekstravazasyonu ve göç belgeleyen için 3B zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirin. Tipik bir satın alma protokolü, her Z-adım için ortalama 15 kare ve 30 saniye aralıklarla 200-225 50μm z adımları bir birim için 21 sıralı 2.5μm elde oluşacaktır.
7. Sonra veri dosyaları laboratuar sunucu üzerinde saklanır, Imaris veya Volocity yazılımı ² izleme çok boyutlu render ve ^{hücre, 3} gerçekleştirmek için kullanılabilir.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Nötrofil hayal 1.Real-time (30f/sec) 200x damarlar boyunca yuvarlanan. Listeria monocytogenes ile enfeksiyon sonrası kırmızı renkte gösterilen 10mins hakkında damarların endotel boyunca zaman atlamalı görüntüleme haddeleme, yeşil, nötrofil gösterir. Bağ dokuda kollajen lifler mavi görünür. videoyu görmek için buraya tıklayınız.

200x nötrofil göçünü dinamikleri 2.Time hızlandırılmış 3D görüntüleme. Tipik nötrofil göçünü iltihaplı doku dolaşım ve göç gösterilmiştir. videoyu görmek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Bu video protokol enflamasyona yanıt olarak, non-invaziv lökosit alımı 2P görüntüleme için prosedürler göstermektedir.

Kapkaççı gibi alerji, enfeksiyon ve otoimmün hastalığı ^4-7 gibi inflamasyon çalışmaları klasik bir fizyolojik sitesidir. 2P görüntüleme, yuvarlanma ve kan damarlarında effektör fonksiyonu siteleri için kemotaksis yapışma, lökosit kaçakçılığı yollar farklı adımları ayrıntılı bir resim sağlar. Biz lökosit işe farklı tipt...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Butler Animal Health Supply	029405
655nm non-targeted quantum dots	Invitrogen	Q21021MP
Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles	Invitrogen	E2862
Listeria monocytogenes (Lm)	Reference 2
Quick gel	Duro
Puralube Vet Ointment	Pharmaderm Animal Health
Insulin syringes	BD Biosciences	08290-3284-38
PBS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30256.02