Kalp Fonksiyonu ve Enerji Kullanımı İzole Fare Kalpler Değerlendirilmesi 31 P NMR Spektroskopisi

Özet

Langendorff-mode ile birlikte izole kalp perfüzyon ³¹ P NMR spektroskopisi bir deney, biyokimya ve fizyoloji alanlarında birleştirir. Protokol dinamik ölçümü için yüksek enerjili fosfat içeriği ve fizyolojik fonksiyonu aynı anda izlerken kalp ciro sağlar. Doğru yapıldığında, bu kalp enerji değerlendirilmesinde değerli bir tekniktir.

Özet

Kaldırılmıs fare modelleri, kardiyovasküler hastalık moleküler değişiklikler ve modeller arasında nedensel ilişkileri belirleyen güçlü araştırma araçları haline gelmiştir. Moleküler biyoloji sinyal yolağı önemli değişikliklerin tanımlanması gerekli olmasına rağmen, fonksiyonel önemi bir göstergesi değildir. Fizyolojisi fizyolojisi sağlam metabolitleri biyokimyasal değerlendirme ile birleştirerek, fonksiyon soru cevaplar sağlayabilir yenerek, kalp, kalp fonksiyonu ve enerji tam bir resim sağlar. Laboratuvarımızda yıl boyunca, bu görevi başarmak için nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ile birlikte izole kalp perfüzyonları kullanmıştır. Sol ventrikül fonksiyonu, kalp enerji yaparak ölçülür Langendorff modu izole kalp perfüzyonları tarafından değerlendirilir

Protokol

1. Bu deneyler için, aynı anda iki ayrı sistem kullanılmaktadır. ³¹ P spektrumları edinimi için Bruker 14T mıknatıs Avance III konsol ve topspin V2.1 yazılımı ile donatılmış bir bilgisayar arayüzü. Kalp fonksiyonunun değerlendirilmesi için, özel bir kalp perfüzyon sistemi, veri analizi için LabChartPro 6 yazılımı ile donatılmış, PowerLab 4 / 30 veri toplama ile arabirim.
2. 0.5mm EDTA, 5.3mM KCl, 1.2mm MgSO _4, 118mm NaCl, ve 25mm NaHCO _3: Deney günü, Krebs-Henseleit tampon 1 litre şu şekilde hazırlanır. Bu karışım daha sonra% 5 _{CO 2} / _O 2 2mm _CaCl 2 ek olarak 10-15 dakika önce için% 95 ile kabarmış . Son olarak, yüzeylerde, 10 mM glukoz ve 0.5mm piruvat şeklinde eklenir.
3. Deney sırasında sıcaklık düzenleme kritik öneme sahiptir. Isıtmalı sirkülatörler 37.0 arasındaki sıcaklık korumak için kullanılır - 37.5 ° C kalp mıknatıs içinde iken. Sıcaklık, bir fiber optik sıcaklık probu kullanarak deney boyunca izlenir.
4. Perfüzyon basıncı ve sol ventrikül basıncı basınç dönüştürücüleri bir veri toplama sistemi ve verilen yazılım kullanılarak görüntülenir üzerinden takip edilmektedir. Bu deneyde önce standart bir tansiyon aleti ile kalibre edilir. Buna ek olarak, basınç hatları tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için yeterince kızardı.
5. 150 mM sodyum fosfat (KH tamponun iyonik gücüne eşdeğer olduğu) standart bir örnek, önce kalp ekleme prob "kalibre" için kullanılır. Bu sinyal kolaylaştırır ve kalp prob içinde konumlandırılmış bir kez satın dönemi başlamak için gereken süreyi azaltır.
6. Koagülasyon azaltmak için, fare, 5 dakika sonra heparin IP 200 Üniteleri, sodyum pentobarbital (175 mg / kg) IP verilir enjekte edilir.
7. Kalp hızla eksize (sağlam akciğerler ve timus ile) ve buz KH tampon tutuklandı.
8. Buz üzerinde tutarken, akciğerleri hızla kaldırılır. Timus lobları tanımlanır ve aort yavaşça ortaya çıkarmak için geri soyulmuş. Timus kaldırılır. Aort sonra herhangi bir çevre doku dikkatlice kaldırarak izole edilmiştir.
9. Mikro dikiş forseps yavaşça aort hem de duvarları lümen maruz tutmak için kullanılır. Aort 0,965 mm OD polietilen boru (PE50) yapılan kanül dikkatlice yerleştirilir. Sütür aort etrafında hızla bağlı aort mikro damar kıskacı ile yerinde tutulur. Klip kaldırılır ve forseps dikkatle kanül aort kökü üzerinde olduğunu kontrol etmek için kullanılır. Ek bağları kalp yerinde tutmak için gerekli olarak eklenir.
10. Herhangi bir ekstra doku forseps ve microscissors kullanarak kaldırılır. Sol kulak kepçesi içine küçük bir kesi yapılır. Yavaşça kalp tutarken A 0.61 mm OD polietilen boru (PI10), apeks ile sol atriyum, sol ventrikül kavite ve dışarı ile dikkatlice eklenir. Aşırı boru kesilir.
11. Deflate bir su dolu balon, AG içine atrium sokulur ve yapışkan bant veya sütür kullanılarak yerinde tutulur. Peristaltik pompa hızı yavaş yavaş kalp için yeterli akışını sağlamak için artar. Kalp NMR prob içine yerine kadar, yaklaşık 2 ml / dk eşdeğer sürekli akışı ile kalp perfüze olmaya devam edecektir. LV basınç dönüştürücü çalışıp çalışmadığını doğrulamak için bir mikrometre şırınga kullanarak küçük bir hacmi ile AG balon şişirilir.
12. Kalp dikkatlice 10 mm NMR tüpe eklenir. Geniş bir delik "spinner", prob içinde uygun pozisyona tüp yardımcı olmak için kullanılır. Tüm aparatları sonra yapışkan bant ile sıkıca "göbek kordonu" eklenir.
13. Kalp / NMR tüpü, 10 mm NMR prob bobin içinde kadar göbek kordonu mıknatıs üst delik içine yavaş yavaş indirilir.
14. Kalp prob içinde uygun pozisyonda sonra, peristaltik pompa akış 80mmHg bir perfüzyon basıncı elde etmek için ayarlanır. (Bu noktaya kadar sürekli bir akış ile yaklaşık 2 ml / dak kalp perfüze olduğunu unutmayın). Perfüzyon basıncı sonra pompa kontrol "hold" mekanizması sağlayarak devam eder. Kalp, 15-20 dakika sonra bir dengeleme dönemi izin verilir. Bu süre zarfında, LV balonun hacmi 8-10 mmHg diyastol sonu basıncı elde etmek için ayarlanır.
15. Dengeleme dönemde, mümkün olan en iyi fosfor sinyal elde etmek için spektrometre parametrelerini optimize etmek için gereklidir. Bu radyo darbe ayarı ve fosfor çekirdeği rezonansa hangi frekansta ("ayar") ("layneri") manyetik alan homojen hale tarafından gerçekleştirilir.
16. Dengelenme periyodundan sonra, birden fazla ³¹ P NMR spektrumları elde edilebilir. Her spektrum için satın alma süresi t bağlıdır.alan mıknatısın gücü, örnek boyutu ve sinyal gürültü oranı belirli bir deney için gerekli. Spectra, 2.0 saniyede bir 60 derece çevirme açısı ve gecikmeler ile 20 ms'den 256 radyo frekans darbeleri elde sinyal ortalama 14 Telsa mıknatıs kullanarak elde edilir. Bu deney, yaklaşık 10 dakika gerekecektir.

Temsilcisi Sonuçlar

Veri toplama ve donanım, LabChart yazılım, kalp fonksiyonu çeşitli parametreler deney protokolünde boyunca ölçülebilir. Kalp fonksiyonu tipik ölçüsü, sol ventrikül gelişmiş basıncı (LVDevP), (Şekil 1) sistolik basınç, diyastol sonu basıncı (EDP) çıkarılarak elde edilir. Bu tedbir, fare zorlanma ve kalp (yani, basınç yükü) durumuna bağlı olarak değişebilir. Ancak, tipik olarak 8-10 mmHg sabit diyastol sonu basıncı 100-110 mmHg arasında normal bir C57BL6 fare kalp LVDevP. Buna ek olarak, LabChart programı LV basınç dalgaları döngüsel ölçümlere göre kalp hızı ölçümü için izin verir. Yine, bu ölçü değişebilir ama kalpleri içsel fiyatla yenmek için izin verildiğinde tipik değerler 350-400 dak. Ancak, kalp, kalp hızı 420 bpm tutulur bir pacing sistemi kullanılarak standardize edilebilir. Buna ek olarak, kontraktilite (+ dP / dt) ve gevşeme (-dP/dt) önlemleri LV basınç dalgası ilk türevi kullanılarak tahmin edilebilir. Deneysel protokol sırasında, bir basınç-hacim ilişkileri dahil ederek Starling mekanizması değerlendirmek için kolaydır. Bu AG balon hacmi yavaş yavaş artar ve LVDevP yanı sıra EDP belirterek tarafından gerçekleştirilir. Bu değerler daha sonra Şekil 2'de gösterilmiştir çizilebilir. Starling eğrisinin 8-10 mmHg bir EDP ulaşmak için gerekli hacim AG kamara boyut dolaylı bir fikir verebilir belirterek, en uygunudur. Bu kontroller ile karşılaştırıldığında daha büyük bir hacim genişlemiş kalpleri ihtiyaç duyarken, genellikle küçük bir balonun hacmi gerektirir hipertrofik kalpleri bantlama aort modelleri kullanılabilir. Tablo 1, perfüzyon protokolü sırasında edinilen temsilcisi kalp fonksiyonu verileri görüntüler.

³¹ P NMR spektrometresi phosphocreatine sinyalleri (PCR) ve ATP (γ-ATP, α-ATP, β-ATP) yanı sıra inorganik fosfat (Pi) Şekil 2'de gösterildiği gibi üç fosfat sağlayacaktır. Bu zirveleri her Analizi eğri altında kalan alan için bir değer sağlar. ATP miktarı γ-ATP ve β-ATP bölgelerde ortalama tahmin edilmektedir. (Α-ATP NAD molekülleri toplam sinyal bilinmeyen bir kısmı katkıda çünkü kullanılmaz). Kalp enerjik durum PCr ve ATP alanlarda (ATP oranı PCr) katsayısı ile belirlenir. 1.7 birincil substrat olarak glikoz ile birlikte bir fare kalp - Bu değer genellikle 1,5 'tir. ³¹ P NMR ATP veya PCr doğrudan tedbirler sağlamamakla birlikte, zirvelerin alanda örnek bileşikler içeren fosfor miktarı ile doğru orantılıdır. Bu sinyaller için değerler, diğer yöntemler kullanılarak tahmin edilebilir. Örneğin, kalplerin bir kohort yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ile ATP doğrudan önlemler, ortalama bir konsantrasyon verim alınabilir. Bu değer daha sonra spektrumları gözlenen ortalama ATP alanlarda kalibre etmek için kullanılabilir. PCr konsantrasyonu ATP alana göre PCr alana göre hesaplanır. PCr sinyali göreceli inorganik fosfat kimyasal kayma (Pi) sinyali analiz ederek pH tahmin etmek de mümkündür. ¹ farklı radyo sinyali dizileri, kreatin kinaz reaksiyon hızı veya ATP sentezi reaksiyon hızı da ölçülebilir. ²

Tablo 1: İzole perfüze kalbinden Temel kalp fonksiyonu. LVDevP: sol ventrikül basıncı; LVEDP: sol ventrikül diyastol sonu basıncı; İK: kalp hızı; CHP oranı: basınç ürünü; + dP / dt: ilk türev LV basınç pozitif; -dP/dt: ilk türev LV basınç negatif, PP : perfüzyon basıncı; CF: koroner akım.

LabChart Pro yazılımı Şekil 1. Temsilcisi LV basınç dalgaları.

Şekil 2 kontrolü (düz çizgi) ve aort bantlı (noktalı çizgi) farelerde Temsilcisi Starling eğrileri. A) Sistolik fonksiyonu olarak artan LV hacimleri üzerinden LVDevP tarafından temsil LV balon birim tarafından belirlenir. B) LV balonun hacmi ile artan LV hacimleri üzerinden EDP tarafından temsil Diyastolik fonksiyonu olarak belirlenir. LVDevP: sol ventrikül basıncı (sistolik eksi diyastolik pressure); EDP: end-diastolik basınç.

Şekil 3. İzole perfüze fare kalp Temsilcisi ³¹ P NMR spektrumları. Nispeten küçük Pi zirve dikkat edin. Glikoz pirüvat veya yağ asitleri ile birlikte bir aerobik perfüze kalp, bu zirve düzeyde olmalıdır. Iskemi dönemlerde, bu pik artar PCr zirve azalır. Α-ATP zirve sağ omuz dikkat edin. Bu NAD moleküllerin katkıdır. Pi: inorganik fosfat; PCr: fosfokreatin; ATP: Adenozin trifosfat.

Tartışmalar

Langendorff perfüze izole fare kalbinde ³¹ P NMR spektroskopisi güvenilir ve tekrarlanabilir bir veri ^{sağlar. 3,} 4 Ancak, LV balon aort ve ekleme kanülasyon Stabil kardiyak performans izin düzgün şekilde yapılması zorunludur NMR içinde iken tüp. Buna ek olarak, sıcaklık düzenlemesi uygun temel işlevleri yerine getirmek için her şeyden önemlidir. Sinyal gürültü oranı iyi analiz NMR spektrumları elde edilmesinde önemli bir faktör artmaktadır. Bu, optimal "ayar" sağlanması ve örnek "layneri" elde edilebilir. Protokol metninde belirtildiği gibi, kalbin takılması için önce standart bir örnek kullanımı kolaylaştırabilir. Yeterli büyüklükte bir "örnek" de yararlı olur. Az 100 mg ağırlığında Kalpler genellikle düşük PCr ve ATP sinyalleri bu nedenle alma süresi artar iyi fosfor spektrumları elde etmek için gerekli olacak sağlar.

Kardiyak fonksiyon ve enerji ile ilgili ek bilgi toplamak için mevcut protokolü değiştirmek için çeşitli yollar vardır. Laboratuvarımızda, yağ asitlerinin farklı kombinasyonları (düşük ve yüksek konsantrasyonlarda), laktat, ketonlar, ve insülin varlığında içerebilir karışık substrat tamponlar ile kalpleri perfüze var. Perfüzyon tampon kararlı izotopların kullanılması (yani, ¹³ C yüzeylerde etiketli), TCA döngüsü etiketli asetil CoA göreceli katkısı substrat kullanımını tahmin etmek yeteneğine sahip bu uygulama için ^5-7, biz gerçekleştirmek isotopomer ¹³ C3-ve ¹³ C4-glutamat ¹³ C NMR spektroskopisi ile analiz. Bu perfüzyon protokol sonunda kalp donma-sıkma ve dondurulmuş doku çıkarma performans gerektirir. Bu analiz, ayrı bir kurulum parametreleri ile farklı bir prob kullanımı gerektirdiği gibi ek bir deney olacak. Zamana bağımlı ^olarak, 31 P-NMR spektroskopisi kullanarak kalp 2-deoksiglukoz fosfat birikimi izleme sırasında diğer uygulamaları ikame tampon deoksiglukoz glikoz içerir . Bu yöntem, miyokard glukoz alımı ölçümü için sağlar. Buna ek ^{olarak 7, 8, 6,} kardiyak iskemi / reperfüzyon ve yüksek iş yükü zorluk oluşan perfüzyon protokolleri fonksiyonu ve enerji laboratuarımızda analiz ^etti. 8-10

Özet olarak, izole fare kalplerinde ³¹ P NMR spektroskopisi sofistike ekipman kullanımını gerektiren teknik olarak oldukça zor bir işlemdir . Ancak, verimi verileri kaldırılmıs fare modelleri fonksiyonu ve enerji analiz etmek isteyen araştırmacı için çok değerli. Laboratuvarımızda, bu tekniklerin, kalp fonksiyonu, enerji ve metabolizma streslerinin çeşitli sonuçları anlayışımız hayati ^{edilmiştir 1, 11,} 12

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magnesium Sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	M7506
EDTA	Reagent	Sigma-Aldrich	E1644
Potassium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	P4505
Sodium bicarbonate	Reagent	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	S7653
Calcium chloride dihydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	C5080
D-Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G7528
Sodium Pyruvate	Reagent	Sigma-Aldrich	P2256
Bruker Ultrashield 600WB Plus	Equipment	Bruker Corporation
PowerLab 4/30	Equipment	ADInstruments	ML866/P
LabChart 6 Pro	Equipment	ADInstruments	MLS260/6
Quad Bridge Amp	Equipment	ADInstruments	ML224
STH Pump Controller	Equipment	ADInstruments	ML175
Minipuls 3 Peristaltic Pump	Equipment	ADInstruments	ML172
Disposable BP Transducer	Equipment	ADInstruments	MLT0699
10mm NMR Sample Tube	Equipment	Wilmad LabGlass	513-7PP-7
Polyethylene tubing PE10	Equipment	BD Biosciences	427401
Physiological Pressure Transducer	Equipment	ADInstruments	MLT844
Polyethylene tubing PE50	Equipment	BD Biosciences	427411
Micrometer syringe	Equipment	Gilmont Instruments	GS-1101
McPherson Forceps	Equipment	Miltex Inc.	18-949
Castraviejo microscissors	Equipment	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5650
Neoptix Signal Conditioner	Equipment	Neoptix, Inc.	Reflex - 1