Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

Özet

Transgenik solucanlar yaygın olarak kullanılır C. elegans Araştırma. Açıklanan DNA kaplı altın parçacıkları ile Biyolistik bombardımanı kullanarak solucanlar transgenlerin tanıtmak için, basit ama etkili bir protokoldür. Transgenik hayvan üretimi için mikroenjeksiyon ile ilgili çaba ve bombardıman sonuçları olumlu karşılaştırın.

Özet

Serbest yaşayan nematod C. kullanarak laboratuvarların sayısı elegans hızla büyüyor. Bu biyolojik model popülerlik hızlı bir nesil zaman ve kısa ömrü, kolay ve ucuz bakım, tam sıralı genom ve RNAi kaynaklarını ve mutant hayvanlar dizisi atfedilir. Ayrıca C, analiz elegans genom, solucan, araştırma yapılan çalışmalarda tüm fareler veya kültür hücreleri için önemli bir yardımcı olabileceğini düşündürmektedir solucanlar ve yüksek omurgalılar arasında büyük bir benzerlik ortaya koymuştur . Güçlü bir solucan araştırma ve önemli bir kısmı gen yerelleştirme ve fonksiyon çalışma transgenik hayvanlar kullanma yeteneği. Transgenik hayvanlar ya solucan germline mikroenjeksiyon yoluyla veya Biyolistik bombardımanı kullanmak suretiyle oluşturulabilir. Bombardıman yeni bir tekniktir ve laboratuarları bir dizi daha tanıdık geliyor. Burada Biyolistik Bio-Rad PDS-1000 sistemi kullanarak altın parçacıkları ile bombardımanı ile transgenik solucanlar oluşturmak için basit bir protokol açıklar. Hermafrodit germline içine DNA mikroenjeksiyon ile karşılaştırıldığında, bu protokol solucan anatomisi tanımlanması veya mikroenjeksiyon performans açısından operatör özel beceri gerektiren bir avantaja sahiptir. Ayrıca birden fazla transgenik hatları genellikle tek bir bombardıman elde edilir. Ayrıca mikroenjeksiyon aksine, Biyolistik bombardıman ekstrakromozomal diziler ve entegre transgenlerin ile transgenik hayvanlar üretir. Entegre transgenik çizgiler elde etme yeteneği, yabancı DNA'nın entegre mutajenik protokollerin kullanımını önlemek. Sonuç olarak, özellikle mikroenjeksiyon az becerikli olmak için gerekli olan zaman ve çaba yatırım ilgilenen araştırmacılar için Biyolistik bombardımanı, transgenik hayvan üretimi için cazip bir yöntem olabilir.

Protokol

Genel bakış

Geleneksel olarak transgenik solucanlar C. transgen DNA microinjecting tarafından oluşturulan elegans germline ^1,2,3,4. Başarılı olsa da, bu yaklaşım, özel ekipman ve solucan anatomi ve mikroenjeksiyon tekniği ile deneyim geliştirilmesi gerekli. Daha yakın zamanlarda Biyolistik bombardımanı germline ^5,6 içine yabancı DNA tanıtmak için DNA kaplı altın parçacıkları kullanan bir alternatif yaklaşım olarak geliştirilmiştir. Bu yaklaşım, uygulama açısından başarılı olmak için daha az zaman yatırım gerektirir.

C. Biyolistik bombardımanı transgenik solucanlar oluşturmak için elegans başarı hayvanların büyük bir miktar gerektirir böylece, bireysel solucanın düzeyde, düşük verimlilik vardır. Bu çeşitli yollarla yetiştirilen, ancak ilgili plakaların çalışma ve sayısını azaltmak için yumurta plakları kullanmayın olabilir. Bizim protokol yumurta plakaları ve solucanlar hazırlanması ile başlar ve daha sonra Bio-Rad PDS-1000/He yedi Sistemi kullanarak bombardımanı protokol üzerinde duruluyor. Biz Berezikov ve ark ⁷ iş kısmen bizim protokol uyarladı.

Bombardımanı ile, unc-119 gen genellikle transgenik hayvanlar için bir belirteç olarak kullanılır. Bu mutasyonu taşıyan Worm suşları ciddi koordinasyonsuz ve zorlukla hareket, görünüm dumpy ve Dauer larva formu ⁸ için mümkün değildir. Dauer olumsuz koşullar altında üreme yetişkin gelişimini geciktirmek için kullanılan bir alternatif larva aşamasında olup, birden fazla genin ⁹ Dauer girmesinden tarafından düzenlenir. Unc-119 geni taşıyan birçok suşları C. edinilebilir. elegans Genetik Merkezi (CGC, Minneapolis, MN). Orijinal DP38 suşu (unc-119 (ED3)) ayrıca mansap deneyler etkileyebilecek alakasız bir Dauer oluşum bünye (Daf-c) mutasyon taşıyor. Çeşitli laboratuvarları bu mutasyon outcrossed ve HT1593 gerginlik CGC edinilebilir. Transgenik hayvanlar DP38 suşu ile biraz daha kolay belirlenir ve bu gerginlik transgenik hayvanlar oluşturmak için kullanma eğiliminde. Gerekli olduğunda, daf-c mutasyon kaldırmak için transgenik solucanlar outcross HT1593 kullanın. Transgenlerin hazırlarken büyüyen plakalarının stok tutmak için DP38 solucanlar büyümeye protokolde yavaş adımları biridir.

İfade ilgi gen ile birlikte unc-119 marker normal motilite ve vücut büyüklüğü ⁵ kurtarma dayalı transgen ifade hayvanların kolay tanımlama sağlar. Unc-119 gen, küçük bir C için çeşitli kaynaklardan ve vektörler unc-119 genomik DNA kullanarak unc-119 organizatörü ve cDNA ve genomik DNA elde edilebilir briggsiae gen ^8,10 kullanılır. Biz son zamanlarda bir unc-119 kaset homolog rekombinasyon ¹¹ ve Cre-lox rekombinasyon unc-119 geni taşıyan transgenik hayvanlar üretmek için ¹² solucan fosmids değiştirmek için bir yöntem ampisilin direnç geninin içeren herhangi bir plazmid eklemek için basit bir protokol nitelendirdi . Plazmid Addgene A.Ş. (Cambridge, MA) mevcuttur.

Tek bir bombardıman gerçekleştiren yer çaba önemli ama yönetilebilir olmasına rağmen, tek bir günde birden fazla bombardımanları yer alan ek iş az. Sonuç olarak, rutin olarak her getirici iş azaltmak için, transgenik solucanlar üretim küme.

1. Yumurta Plaka Hazırlık

Unc-119 mutant solucanlar, çünkü bir tabak parçaları plaka diğer bölgelerinde hala yiyecek içeren süre açlıktan eğilimindedir engelli hareketlilik ile standart NGM plakalar üzerinde büyümek zor. Yumurta plakalar üzerinde kalın gıda tabakası unc-119 solucanlar daha kolay tarama ve tüm plaka ⁷ devralmaya izin Yumurta plakaları bu sorunu çözebilir. Yumurta plakaları da, solucanlar çok sayıda az ^plakaları 13 ihtiyaç vardır böylece büyümeyi destekleyen yararı var . Genellikle 5 yumurta plakaları, bir bombardıman için solucanlar büyümek için yeterli. Aşağıda tarif yaklaşık 50 plaka yapar ama, istenirse daha az yapmak için yarıya olabilir.

Plakalar, antibiyotik ve antifungal ilaçlar kullanın ve sadece tabak tohumlama için hipoklorit tarafından üretilen yumurta kullanın, böylece yumurta plakaları kolayca kontamine olabilirler.

1. Gün:

1. 500ml şişe LB (400 mL) hazırlayın. Otoklav için 20 dk.
2. ~ 50% 2 agar ile 1 litre NGA kullanarak 10 cm NGA plakaları dökün. 200 mg / ml ¹³ litre ve streptomisin başına nistatin 10 ml ekleyin.
3. 200 mg / ml streptomisin, LB OP50-1 40 ml gecede kültür büyütün. Bu gerginlik, streptomisin dirençli ve CGC edinilebilir.
4. 500ml şişe OtoklavErtesi gün.

2. Gün:

1. Ayrı steril şişeye 10 tavuk yumurtası sarısında bulunur. Biz bir yumurta sarısı ayırıcı (Hedef de dahil olmak üzere ev mağazalar, mevcuttur) kullanın. Çalkalayınız.
2. LB ile 400ml hacim kazandırın. Sallamak
3. 1 saat 60 ° C'de inkübe edin.
4. Oda sıcaklığında soğutun.
5. OP50-1, 40ml ekleyin. Sallamak
6. Plaka başına 5-8 ml karışımı dağıtın.
7. Plakalar gece boyunca oda sıcaklığında yerleşmek için izin verin.

3. Gün:

1. Plakaları kalan sıvı yavaşça dökün. Gece boyunca oda sıcaklığında kapakları ile kurumasını bekleyin.

4. Gün:

1. Gerekli ° C kadar bir kutu ya da plastik torba ve mağaza, 4 tabak koyun. Bu plakalar, 1-2 ay kullanmak için Tamam gibi görünüyor.

2. Yumurta Tabaklar Seeding

1. Konsantre OP50 son açlıktan plakaları ekleyerek 6 cm NGA plakalar üzerinde DP38 solucanlar genişletin. Tek bir bombardıman için, tohum 5 yumurta plaka ~ 6 küçük tabak kullanın. Birden fazla bombardımanları için, biz, yumurta plakaları ekim önce yerine tohum 2 zenginleştirilmiş pepton plakalar için küçük tabak kullanın.
2. DP38 solucanlar ^13,14 hipoklorit kullanımı ile yumurta Yalıtmak. Steril S-bazal veya M9 tamponlar ^13,14 yumurta tekrar
3. Yumurta plakaların uygun sayıda yumurta (plaka başına 10.000) ekleyin. Bombardımanı kullanmak için 7-10 gün boyunca 20 ° C'de yumurta plakalar üzerinde solucanlar büyütün. Plakalar, solucanlar, yemek tabakları temizlemek için bir kez başladıktan sonra kullanıma hazır olacaktır. Bu plakalar, açlıktan ve daha uzun süreler için büyüyen solucan verimi artıracak gerçekten zor.

Bombardıman

Önümüzde zaman altın stoku hazırlamak ve 4 ° C kullanılmak üzere saklanır tutmak. Ayrıca gerekli lekesiz ve 10 cm NGA tabak fark vardır. Lekesiz plakaları önceden iyi dökülür ve iyice kurumasını solucanlar ile eklenen sıvı emilimini kolaylaştırmak için izin verilmesi gerekir.

DNA kaplı altın parçacıkları, ilk önce hazırlamaya başlamadan bombardıman gününde, solucanlar yıkayın. Biz lekesiz NGA plakaları sonra solucanlar ve altın parçacıkları yıkama ve macrocarriers aktararak bitirmek.

Altın parçacık hazırlanması:

1. 1.7mL bir tüp içinde altın parçacıkları 60 mg tartılır ve 15 dakika için% 70 etanol içinde bekletin. Spin altın parçacıkları çöktürmek için kısaca.
2. 3 kez steril su ile yıkayın ve altın toplamak için kısaca her zaman döndürün.
3. % 50 steril gliserol 1mL altın süspanse edin. Bu stok altın parçacık çözümü ve 4 ay süreyle saklanabilir ° C

Worms:

1. S-bazal veya M9 tamponu ile yumurta plakaları kapalı DP38 solucanlar Float ve 50ml konik tüp aktarabilirsiniz.
2. Tüpler, solucanlar alt kadar bankta tutun. Sonra tampon aspirat ve taze S-bazal veya M9 ekleyin. Tampon enkaz nispeten netleşene kadar, 2 veya 3 kere yıkayın. DNA kaplama işlemi tamamlanıncaya kadar, bu aşamada solucanlar tutun.
3. Aspire edin ve yaklaşık 2-3 ml bombardımanı ortalama tamponunda solucanlar bırakın. Buz üzerinde 10 cm lekesiz NGA plaka transfer. NGA plaka bombardımanı önce tamamen kuru olarak transfer hacmi en aza indirmek önemlidir. Solucanlar plakanın tüm yüzeyini kapsayacak şekilde emin olun.
4. Plaka buz üzerinde kurumasına izin verin. Buz kurutma sırasında topaklanma solucanlar önleyecektir.

Bu adım önemlidir: tabak kuru olmalıdır ve solucanlar NGA plaka üzerinde eşit dağılmış. Solucanlar buz üzerinde tutulması, plaka üzerinde hareket eden ve yığınları içine bir araya engeller.

DNA hazırlığı (bir bombardıman için):

1. 1.7mL bir tüp içinde karıştırın:
   • 50μl altın parçacıkları. Eklemeden önce iyice süspanse edin.
   • 50μl DNA (10-15ug). Biz dairesel veya doğrusal DNA arasında çok az fark görüyoruz. Genellikle (Qiagen Inc, Valencia, CA) DNA saflaştırılması için Qiagen midiprep kartuşlarını kullanın.
   • 50μl 2.5M CaCl _2. Bu çözüm, oda sıcaklığında birkaç hafta boyunca stabildir.
   • 20μl 0.1M spermidin.
     
     Spermidin sulu çözeltide kararsız. -20 ° C'de 70μl spermidin alikotları ve mağaza olun Daha sonra bir 0.1M çözüm elde etmek için sağa kullanımdan önce su 1 ml ekleyin. Bu çözüm, her bombardımanı için taze hazırlanmış olmalıdır.
     
     Vorteks Biz genellikle vorteks sonra düşük bir hızda 1.7mL bir tüp içinde altın parçacıkları ve CaCl _2, DNA ve spermidin / protamin damla damla ekleyin. Kalsiyum fosfat ile transfekte olan insanlar için bu tekniği tanıdık.
     
     Biz çok iyi sonuçlar ¹⁵ ile yerine spermidin protamin da kullanılır. Biz su taze bir çözüm (1mg/ml) hazırlayacak ve bizee 50μl yerine spermidin 20μl. Eğer protamin kullanımı, genellikle buz üzerinde yerleştirme yerine 10 dakika boyunca karışımı oda sıcaklığında inkübe edin. Protamin dondurulmuş tutulmalıdır gerekmez ve bir toz bir sıvı yerine.
2. 30 dakika için buz karışımı inkübe ve süspansiyon altın parçacıkları tutmak için periyodik olarak karıştırın. Daha sonra kısaca spin ve süpernatant aspire.
3. 300μl% 70 etanol ile yıkayın. Kısaca Spin.
4. 1 ml% 100 etanol ile yıkayın. Kısaca Spin.
5. 170μl% 100 etanol içinde süspanse edin.

Macrocarriers, hazırlanması:

1. 2-propanol içinde 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) durulayın. Kağıt mendil koyun ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
2. Her macrocarrier merkezinde DNA / altın karışımı 20μl ekleyin. Süspansiyon altın tutmak için pipetleme önce vorteks sağ emin olun.
3. Buharlaşması etanol edelim.

3. Bombardıman

Deney sistemi yoluyla helyum temizlemek için önce boş bir bombardıman gerçekleştirmek için emin olun.

1. , Vakum pompası ve yakın vakum pompası kapanı açın. Biz yağsız vakum pompası kullanın.
2. Helyum tankı açın. Basıncı ≥ 2200psi kontrol edin.
3. 2-propanol içinde Islak rüptürü disk (1350 psi), yedi adaptör için istinat kap yerleştirerek.
4. PDS-1000 sistemi içine adaptörü Vida ve verilen tork anahtarı ile sıkın.
5. 7 sahibi ve koltuk onlara sağlanan bir aracı haline macrocarriers yerleştirin. Sonra sahibine yedi stop ekran ve alt koydu. Üst ikinci raf üzerinde yer tutucu ve çevirin. Macrocarriers altın benekli tarafı bu noktada aşağı bakacak şekilde olmalıdır.
6. Yedi adaptör çıkışları ile macrocarrier sahibinin üst deliklerini.
7. Bombardıman odasında en düşük raf solucanlar (kapak kapalı) ile kaplı NGA plaka koyun.
8. Tamamen PDS-1000 vakum debi topuzu açın. Vac düğmesine basın odası Hg olarak 26 ulaşana kadar. Sonra vakum korumak için konumda tutun geçmek.
9. Disk rüptürlerinin kadar yangın düğmesine basın ve basılı tutun. Basınç 1350psi ulaştığında bu olur. Bazen bu meydana 5-20 saniye sürer. Düğmesini bırakın.
10. Vakum odası (havalandırma pozisyon) bırakın ve plakasını çıkarın.
11. Vakum ve helyum kapalı açın.
12. Yangın hattı helyum (helyum göstergesi 0 psi işaretlemeniz gerekir) içermez kadar birkaç kez.
13. PDS-1000 sistemi kapatın.

Bombardımanından sonra Worm kurtarma:

1. 20 ° C'de 20 dakika boyunca bombardımana plaka bırakın.
2. 10 ml S-bazal veya M9 tampon plaka solucanlar Float.
3. 20 - 10 cm benekli NGA plakaları 0.5mL solucanlar koyun.
4. Yaklaşık 2 hafta ° C ya da oda sıcaklığında (22-24 ° C) kurtarıldı solucanlar için kontrol etmeden önce 20 bırakın.
5. Diseksiyon mikroskobu ile unc-119 (+) fenotipi ile solucanlar için ekran. Kurtarıldı solucanlar kurtarıldı olmayan solucanlar üzerinde sağkalım avantajı beri plakaları açlıktan sonra tarama için en uygun zaman.
6. Kurtarıldı solucanlar bulunan her 10 cm plaka tek bir hat oluşturun.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Transgenik hayvanlar elde etmek için ilgili protokolün başarısı özellikle transgen bağlıdır. Organizatörü: GFP muhabiri transgenlerin 20 satır kadar almış. Daha tipik bir sonucu 3-10 satır. Transgenik hatların% 30 entegre çizgiler, ancak bu rastgele ve entegre bir çizgi özellikle isteniyorsa, biz tek bir günde birden fazla bombardımanları gerçekleştirecek.

Tartışmalar

Biyolistik bombardımanı C. dahil olmak üzere, birçok organizma içine yabancı DNA tanıtmak için basit bir yöntem elegans ^1,5,6,7,16. CaCl ₂ varlığı DNA ile bir kompleks oluşturan altın parçacıkları dayanmaktadır. Katyonik poliaminler, böyle bir spermidin olarak, in vivo nükleaz bozulması DNA korur. Spermidin labil bir molekül olduğu için, küçük alikotları -20 ° C'de saklayın ve sağ bombardımanı gerçekleştirmeden önce çözüm için önemlidir...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold particles	Inbio gold	BD021	1micron
Midiprep kit	Qiagen	12143
Spermidine	Sigma-Aldrich	S4139
Protamine	Sigma-Aldrich	P4505
Macrocarriers	Bio-Rad	165-2335
PDS-1000/He Hepta System	Bio-Rad	165-2257
Rupture disk	Bio-Rad	165-2330
Nystatin	Sigma-Aldrich	N1638
Streptomycin	MP Biomedicals	100556