DNA Fragments Electroeluting

Özet

Bu prosedür, yüksek verim DNA parçalarının arıtma sağlar.

Özet

Saf DNA parçalarının Moleküler Biyoloji farklı amaçlar için kullanılır ve çok sayıda prosedür tarafından hazırlanmış olabilir. Çoğu ilgi grup ayırmak için, DNA parçalarının bir önceki elektroforez gerektirir. Sonra, bu grubun bir agaroz veya akrilamid jel eksize edilip kullanarak saflaştırılmış: cam veya silika partikülleri, DEAE-selüloz membranlar, bağlayıcı ve elüsyon "yöntemi ezmek ve emmek" electroelution ya da çok sık pahalı ticari arıtma kitleri. Böylece, bir yöntem seçerek çoğunlukla laboratuvar mevcuttur ne bağlı olacaktır. Electroelution prosedür uygulamaları çok sayıda (sıralama, Radyoaktif, enzimatik kısıtlama, enzimatik modifikasyonu, klonlama vb) kullanılmak üzere çok temiz DNA arındırmak için izin verir. Bu prosedür yerleştirerek oluşur DNA bant-sonra uygulayarak mevcut electroeluter örnek kuyu, içine agaroz veya akrilamid dilim içeren DNA parçalarının agaroz bırakmak yapacak ve böylece daha sonra etanol yağış ile kurtarılamaz bir yastık tuz hapsedilir.

Protokol

1. Arındırılmalıdır ilgi DNA parçaları seçmek için, bu agaroz çözülebilir veya akrilamid jeller 1 saat için 120 volt 0.5x TBE tamponu (Tris borat, EDTA) kullanılarak elektroforez etidyum bromür ile boyanmış jel. Bunun için, plazmid pProEx-GdMre11S ~ 700 ng (6000 bp), daha önce NdeI ve HindIII ile sindirilir 900 bp parçası (parçası plazmid ve 84 ng 560 ng) serbest bırakmak için kullanılır.
2. Electroeluter tankı (Şekil 1), orta plato üzerine onu dökmeyin özen orta platonun her iki tarafında eşit olarak dağıtılmış 0.5x TBE ile doldurulması gerekir.
3. Seçilen grubun (veya grup) jel kesip, numune odasında V kanal (her bir dilim) mümkün olduğunca yakın olarak yerleştirilir. Koşu tampon her iki mecliste de eklenmelidir; jel dilim karşılamak için yeterli.
4. Sıkışmış olan herhangi bir hava kabarcığı ortadan kaldırmak için kullanılan her V kanalı Pasteur pipeti ile yıkanmalıdır.
5. Sonra 10 M NH ₄ asetat (Bromophenol Mavi küçük bir miktar yeterli renk eklenir, görselleştirme kolaylaştırmak için) 100 ul V kanal içinde yavaşça eklenir.
6. Yüksek tuz yastık herhangi bir tabanda önlemek için kapağı hafifçe kapatılmış olmalıdır.
7. Electroelution 25 dakika için 100 volt başlandı.
8. Electrolution tamamlandığında, 400 ul V-kanal kaldırıldı ve 1 saat veya gece boyunca soğuk etanol ve glikojen (DNA kurtarma artırmak için önerilir) 2 cilt, 4 ° C ile çöktürülmüş mikrofuge'de tüp yerleştirilir.
9. 20 dakika boyunca santrifüj, süpernatant kaldırmak ve% 70 etanol ile yıkayın.
10. Kuru tüp ve OD 260 nm DNA ölçmek.
11. Elde edilen geri kazanım oranı% 75 idi (84 ng V-kanal yerleştirildi 63 ng iyileşti).

Şekil 1 Electroeluter diyagramı. Anot, bir katot dilimlenmiş jel bulunan tank, DNA her tarafında gösterilir (siyah kare olarak gösterilen) negatif yük nedeniyle katot doğru göç edecek. Sonra V-kanal bulunan tuz minder ters bir siyah üçgen olarak temsil kalmış olacak.

Tartışmalar

Çalıştırma süresi kadar parçaları için normalde parçalarının boyutu çok bağlı olacaktır küçük parçaları için her 10 dakikada bir izleme UV ışık geçmek parçası önlemek için gerekli iken 20 kb 1 saat 50 dakika yeterlidir tuz yastık ve dolayısıyla kurtarma azalan anodal tampon odasına. 100 volt güç kaynağı, bir akım en az 10 mAmp olduğunu emin olmak için çok önemlidir. DNA bant UV el lambası ile izlenmekte ve bu jel dilim ne zaman terk tespit edilebilir. Yastık tuz 3 M Na asetat ile de yapılabilir.

Bu prosedür, modifiye enzimler, vb. Tarafından işlenen iyi kurtarma (~% 80) ile farklı boyutlarda DNA veya RNA parçaları arıtma kısıtlama enzimler tarafından sindirilemez, radyoaktif olması

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
NdeI	New England Biolabs	R0111L
HindIII	New England Biolabs	R0104L
NH4 acetate	JT Baker	0596
agarose	Invitrogen	15510-027
Biophotometer	Eppendorf	6131 000 020
Electr–luter	IBI	UEA CAT 46000