Kararlı İzotopik Profil geliştirilmesi ve Yetişkin Sahne Aracı Metabolik Akı Caenorhabditis elegans</em

Özet

Kararlı izotop profil aracı metabolik akı gaz kromatografisi kütle spektrometrik analizi, nematod açıklanan Caenorhabditis elegans. Yöntem, karbon dioksit, organik asitler, amino asitler ve agar plaklarına gelişimi sırasında ya da sıvı kültür yetişkinlik döneminde ya izotop maruz izotopik zenginleştirme değerlendirilmesi için ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Özet

Kararlı izotop profil uzun hassas araştırmalar, genetik mutasyonlar ve / veya hücresel ve memeli modellerinde farmakolojik tedaviler metabolik sonuçları izin verdi. Burada, nematod, Caenorhabditis elegans aracı metabolizma ve metabolik akı kararlı izotop profil gerçekleştirmek için detaylı yöntemleri açıklar. Yöntemler çeşitli farmakolojik tedavilere maruz kaldığında, genç yetişkinler olarak nematod büyüme medya agar plaklarına veya başından erken gelişim ya kararlı izotopu maruz hayvanların tüm solucan serbest amino asitler, etiketli karbon dioksit, etiketli organik asitler, amino asitler ve etiketli profil için açıklanan sıvı kültürü. Serbest amino asitler,% 4 perklorik asit çıkarılan tüm solucan alikotları yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ile nicel. Evrensel etiketli ¹³ C-glukoz veya 1,6 - ¹³ C _2-glukoz, etiketli karbon, karbon dioksit kütle spektrometresi (hem atmosferik ve çözünmüş) yanı sıra, glikoliz yoluyla akı göstergesidir metabolitleri tarafından takip kararlı izotop habercisi olarak kullanılmaktadır pirüvat metabolizma ve trikarboksilik asit döngüsü. Temsilcisi (isp-1 (qm150) izotopik esas mitokondriyal kompleksi III mutant solucanlar gibi göreceli bir ölçüde, yabani tip nematod izotop pozlama süresi etkileri, çeşitli bakteriyel temizleme protokolleri ve alternatif solucan bozulma yöntemleri göstermek için dahil edilmiştir ) yabani tip solucanlar göre. Yaşayan nematod kararlı izotop profil Uygulama bireysel genetik bozukluklar ve / veya farmakolojik tedaviler neden olan bütün hayvan düzeyinde gerçek-zamanlı metabolik değişiklikler araştırmak için yeni bir kapasite sağlar.

Protokol

Protokol A: C. sırasında aracı metabolizma Kararlı izotop profilleme NGM plakaları elegans gelişimi.

* Not: Kararlı izotop zenginleştirme izotop maruz kalma (ya da evrensel etiketli ¹³ C şekeri veya 1,6 - ¹³ C _2-glukoz) başarıyla, genç yetişkin nematod popülasyonları içinde ölçülen olabilir ya erken gelişimi ya da erken erişkinlik döneminde başlayan . Bu protokol, hayvan sağlığı, geliştirme ve standart sıvı kültüründe kolayca elde değildir nematod büyüme ortamı (NGM) plakaları, büyüme eşzamanlı izleme kolaylaştırır.

1. Standart tekniği başına 10 ml (NGM) nematod büyüme ortamı ile ¹ 100 mm Petri kapları hazırlayın.
2. OP50 E. Spread NGM plakalar coli ¹ ve gece boyunca kurumasını bekleyin.
3. ¹³ C ₂ glukoz (10 mM NGM plaka üzerinde bir final konsantrasyon elde etmek için) düzgün plaka - 200 mM 1,6 500 mcL ekleyin. Gece boyunca kurumaya bırakın.
4. Bleach gravid erişkin solucanlar ^{1. 13} C şekeri ₂ - Plaka, bakteri ya da 1,6 olmadan NGM tabaklarda yumurta iyileşti . 20 ° C'de bir gece inkübe edin.
5. Ertesi gün, daha önce 1,6 ile yayılır NGM plakalar üzerine yumurtadan, L1-tutuklandı larva ^transferi 13 _C 2-glukoz ve OP50 E. - coli (yukarıda adım # 2, başına). Dikkate alarak solucanlar, genç yetişkinlik evresi (48-72 saat, gerginlik bağlı olarak) solucanlar büyür, açlıktan yok.
6. S. Bazal 3-4 ml plakalar senkron, ilk gün genç erişkin solucanlar toplayın.
7. 50 ml 50 ml Falcon tüpler S. Bazal solucanlar yıkayın. 5 dakika boyunca ağırlık pelet için solucanlar izin verin. ~ 5 ml süpernatantı. Iki kez daha yıkayın tekrarlayın.
8. Üç 100 mcL alikotları ² sayarak solucan sayısını tahmin. 1000 solucanlar / S. bazal mL solucan konsantrasyon ayarlayın.
9. 1.5 ml plastik santrifüj tüpü içine Pipet 1 ml (1000 solucanlar).
10. 69% 60% 4 PCA ve iç standart 200 mol nihai konsantrasyonu içeren internal standart (ε-aminocaproic asit) PCA mcL ekleyin.
11. Kurtçuklar ağırlık x 5 dakika dinlendiriniz. Başka bir tüp içinde süpernatantı ve kaydedin.
12. 15 saniye boyunca plastik homojenizatör (Kontes Pelet havaneli) ve motorlu matkap (Kontes Pelet havaneli Şarjlı Motor) kullanarak solucan örnekleri Grind. Görme ışık mikroskobu solucan bozulması onaylayın. Gerekirse tekrarlayın.
13. Homojenat ile birleştirmek için adım adım # 12 # 11 süpernatant aktarın.
14. 5 dakika 2250 rpm (1300 xg) örnek santrifüjleyin.
15. 7 ml cam tüp taze süpernatant transfer. Aşağıda, # 20 adımda ayrıntılı olarak, protein konsantrasyonu tayini için pelet.
16. 4N KOH kullanarak 7-8 (nötr) aralık pH örnekleri.
17. Tuzları kaldırmak için 5 dakika için 2250 rpm (1300 xg) 7 ml cam tüp içinde nötralize örnekleri santrifüjleyin.
18. 7 ml cam tüp taze süpernatant transfer.
19. Metaboliti kantitatif nötralize örnekleri hazırlayın:
    1. Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi (HPLC): Ayrı 50 mcL HPLC içine direkt enjeksiyon için nötralize örnek. Serbest amino asit kantitatif açıklandığı gibi, daha önce ^3-4 HPLC (Varian), o-fitalaldehid ve floresan tespiti ile ön sütun türevlendirme kullanarak yapılır.
    2. Gaz Kromatografisi / Kütle Spektrometresi (GC / MS): PROTOKOL D. ayrıntılı olarak GC / MS, amino asitler ve organik asitler izotopik zenginleştirme belirlenmesi için iyon değişim reçinesi (Bio-Rad) kullanarak kalan nötralize örnekleri, çıkarılması ile devam
20. (Adım # 15) 7 ml cam tüp içinde kalan protein pelet 1N NaOH 1 ml ekleyin.
21. Eriyene kadar döner (Labnet * LabRoller Rotator) gece ise oda sıcaklığında inkübe protein örnek NaOH tedavi.
22. 75-100 mcL NaOH ile tedavi edilen protein, protein konsantrasyonu standart yöntemler (DC Protein Testi, Bio-Rad) belirlemek için kullanın.

C. aracı metabolizma Protokolü B. Kararlı izotop profil elegans sıvı kültüründe genç yetişkinler.

* NOT: yetişkin nematod aracılık metabolik akı Farmakolojik etkileri NGM plakalar ya döşeme yumurta ilk gününde izotopik maruz başlamasını takip çalışıldı (bkz. Protokol, yukarıda) ya da sıvı kültür olabilir. Biz stabil izotop ve farmakolojik ajan kullanımı maliyet verimliliği en üst düzeye çıkarmak için ikinci bir yaklaşımı tercih ederler.

1. Sulandırınız senkron, ilk gün yumurta döşeme bazal S. 500 mcL başına 2000 hayvanların% 0.0005 kolesterol içeren (Bazal S. 1L için 0,5 mL% 1 kolesterol (% 95 Etanol içinde çözünmüş) ekleyerek elde) genç yetişkinler.
2. Aşağıdaki gibi ~ 4 mL toplam hacmi kültür (ler), 25 ml'lik Erlenmeyer şişeler içinde ayarlayın:

   TEDAVİ:	YOK	"İLAÇ A"
   Kolesterol ile S. Bazal	3020 mcL	3020 uL - "İlaç" hacim
   Kararlı İzotop (1,6 - 13 C 2-glukoz)	80 mcL	80 mcL
   K12 E. coli (OD 660 2,5-3)	400 mcL	400 mcL
   Genç Yetişkin Worms (2.000)	500 mcL	500 mcL
   İlaç A (istenen konsantrasyon)	-	Istediğiniz gibi

3. Matara folyo ile örtün. 220 rpm'de 24 saat boyunca 20 ° C inkübe platformu çırpıcısı şişeler iyice çalkalayın.
4. Oksijen ara metabolik akı ve endojen nematod metabolitleri etiketleme çıkan için gerekli olduğu gibi şişeler tamamen kapalı değildir, emin olun.
5. 4 mL kültür hacmi 46 ml, 50 ml konik plastik tüp S. bazal ekleyerek solucanlar yıkayın. 5 dakika boyunca ağırlık pelet için solucanlar izin verin. Supernatant Vakum emme ~ 5 ml kalır. S. bazal ile 50 ml tüp dolum iki kez daha tekrar yıkayın.
6. Yıkanmış solucanlar, 1.5 ml plastik santrifüj tüpüne 1000 solucanlar / mL konsantre ol.
7. 200 mol internal standart bir son konsantrasyon ve% 4 PCA elde etmek için,% 60 perklorik asit (PCA) 69 mcL ve 10 mcM internal standart (ε-aminocaproic asit) 2 mcL ekleyin.
8. # 11-22 PROTOKOL A. adım başı olarak numunesinin

PROTOKOL C-1. Tabaklarda erişkin solucanlar izotopik kullanımı ve çözünmüş atmosferik karbondioksit etiketli karbon izleme izleme.

* NOT: A ve B ayrıntılı yöntemleri PROTOKOLLERİ Oysa kısa bir süre içerisinde, sırasıyla, geliştirme veya yetişkin yaşamda 1 gün 2-3 gün içinde serbest metabolitleri içine solucanlar içinde brüt onay izotopik esas başarı ve kinetik izotop dahil izlemek için (yani, saat dakika), solucanlar serbest veya solucan ekstraktı içinde çözünmüş karbon dioksit bulunan atmosferdeki karbon dioksit (CO ₂₎ izleme etiketi ile elde edilebilir . Canlı veya öldürülmüş bakteri, levhalar (PROTOKOL C-1) üzerinde büyüdüğü zaman solucanlar beslenebilir. Bakteriler, solucanlar sıvı kültür kısa vadeli izotop maruz kalma (PROTOKOL C-2) için gerekli değildir.

1. NGM agar 10 mL ile 100 mm Petri kapları hazırlayın. Canlı veya UV-öldürülen ya OP50 E. NGM plakaları yayıldı coli (Şekil 1'de gösterildiği gibi). Plakaları gecede kurumasını bekleyin.
2. 200 mM 500 mcL 1,6 ^etiketli-13 C _2-OP50 yayılmasını NGM plakaları (10 mM NGM plaka üzerinde nihai izotop konsantrasyonu için) glikoz. Plakaları gecede kurumasını bekleyin.
3. Elde senkron, ilk gün yumurta, NGM agar plaklarına yetiştirilen genç erişkin solucanlar sadece OP50 E. ile yayıldı coli.
4. Stabil izotop ve E. içeren deneysel NGM agar plaklarına 1000 genç erişkin solucanlar aktarın coli (yukarıda adım başı 1-2, olarak hazırlanan).
5. Hassas atmosfer örnekleme ve değiştirilmesi için izin vermek iyi mühürlü 3-yollu stopcock ile donatılmış özel cam odasında Yeri deneysel NGM plaka (kapaksız). Hemen optik şeffaf cam disk odaları mühür. Cam disk kapatmak için yüksek vakum gres ile plaka üzerinde oturur dikiş örtün. "Zaman 0" olarak kaydedin.
6. 3-yollu, 30, 60, 90 ve 120 dakika, 20 ml şırınga ile stopcock tarafından cam odasından atmosfer örnek 10 ml. Önceden hazırlanmış 10 ml lastik tıpa her atmosferik örnek transfer mühürlü vakum 0.1 N NaOH 1 mM NaHCO ₃ 1 ml cam tüp içeren tepesinde.
7. Hava geri 10 ml, 20 ml şırınga kullanarak 3 yönlü stopcock ile her bir cam odasına enjekte edilir. Atmosfer örnekleme / reinjecting sonra ve toplama noktaları arasındaki kuluçka başlamadan önce odasına stopcock kapatın.
8. Atmosferik CO ₂ örnek içeren cam tüp içine 10 ml lastik stoper stoper 100 mcL ile% 20 fosforik asit enjekte edilir tepesinde .
9. Atmosferin 2 mL çıkarın ve 12 mL mavi-top otomatik örnekleyici tüpler, helyum ile atmosferik _CO 2 ölçümü için önceden dolu enjekte .
10. Gaz Oranı Kütle Spektrometresi (ThermoQuest Finnigan Delta Plus) tarafından "atmosferik CO ₂ örnek" analiz edin.
11. Açık cam odaları iki saat atmosferik tüm örneklerin izotop kuluçka dönemi ve toplama.
12. S. bazal 3 mL kullanarak NGM plakaları solucanlar yıkayınız.
13. 50 ml, 50 ml Falcon tüpler S. bazal solucanlar yıkayın. Yıkayın iki kez daha tekrarlayın.
14. 7 ml yuvarlak alt cam tüp (ler) ~ 1000 solucan / ml solucanlar Konsantre.
15. Vakumlu lastik tıpa ile cam tüp.
16. 100 mcL ekleCO ₂ çözünmüş serbest bırakmak için şırınga ile lastik tıpa ile% 20 fosforik asit.
17. Atmosferin 2 mL çıkarın ve 12 mL mavi-üst otomatik örnekleyici tüpler, helyum ile çözünmüş _CO 2 ölçümü için önceden doldurulmuş içine enjekte edilir .
18. Gaz Oranı Kütle Spektrometresi (ThermoQuest Finnigan Delta Plus) tarafından "çözünmüş CO ₂ örnekleri" analiz edin.

Alternatif Protokolü (C-2): sıvı kültüründe erişkin solucanlar ve çözünmüş atmosferik karbondioksit etiketli karbon izleme izleme izotopik kullanımı.

1. OP50 E. ile yayılır NGM agar plaklarına yetişen senkron, ilk gün yumurta, genç erişkin solucanlar alın coli.
2. 50 ml 50 ml Falcon tüpler S. bazal solucanlar yıkayın. 5 dakika boyunca ağırlık pelet için solucanlar izin verin. ~ 5 ml süpernatantı. Tekrar iki kez daha yıkar.
3. 1000 genç erişkin solucanlar, 1 ml, S. bazal 10 ml yuvarlak alt cam tüp aktarın. Evrensel-etiketli ¹³ C-glikoz, solucanlar, 1 ml 10 mM nihai konsantrasyonu elde etmek için 1 M stokunun 10.1 ul ekleyin .
4. , 2 dakika süreyle açık tüp% 100 oksijen akan atmosfer alışverişi solucanlar ve izotop içeren Oxygenate yuvarlak alt cam tüp. Kauçuk tıpa ile boru derhal kapatın.
5. 220 rpm'de 20 ° C'de inkübe platformu çalkalayıcı deney tüpleri çalkalayın. , "Zaman 0" olarak zaman başlangıç ​​kaydedin.
6. Atmosfer örnek 5 ml, 30, 60, 90 ve 120 dakika lastik tıpa ile, 10 ml şırınga ve 25 gauge iğne kullanılarak 10 ml yuvarlak alt cam tüp.
7. Önceden hazırlanmış, lastik tıpa her atmosferik örnek transfer mühürlü vakum 0.1 N NaOH 1 mM NaHCO ₃ 1 mL içeren 10 ml cam tüp tepesinde.
8. 10 ml şırınga ve 25 gauge iğne kullanılarak lastik tıpa ile solucanlar ve izotop içeren her deneysel yuvarlak alt cam tüp içine 5 ml hava geri enjekte edilir.
9. Toplama noktaları arasındaki 220 rpm'de sallayarak solucanlar ve izotop içeren deneysel 10 ml yuvarlak alt cam tüpler inkübasyon devam et.
10. 10 ml cam tüp, kauçuk tıpa içeren atmosfere stoper 100 mcL ile% 20 fosforik asit enjekte edilir tepesinde.
11. Atmosferin 2 mL çıkarın ve 12 mL mavi-üst otomatik örnekleyici tüpler, helyum ile atmosferik _CO 2 ölçümü için önceden dolu içine enjekte edilir .
12. Gaz Oranı Kütle Spektrometresi (ThermoQuest Finnigan Delta Plus) tarafından "atmosferik CO ₂ örnek" analiz edin.
13. Deney süresi sonunda, 50 ml, 50 ml Falcon tüp S. bazal solucanlar yıkayın. Solucan pelet ağırlık oluşturmak için izin ver. Supernatant Vakum emme ~ 5 ml kalır. S. bazal 50 ml iki kez daha tekrarlayın yıkayın.
14. 7 ml yuvarlak alt cam tüp ~ 1000 solucan / ml solucanlar Konsantre. Kauçuk tıpa ve vakumlu tüp ekleyin. % 20 fosforik asit çözünmüş solucan CO ₂ serbest bırakmak için lastik tıpa ile 25 gauge iğne ile 1 ml şırınga kullanarak 100 mcL ekleyin.
15. 2 mL atmosfer çıkarın ve 12 mL mavi-üst otomatik örnekleyici tüpler, helyum ile çözünmüş _CO 2 ölçümü için önceden doldurulmuş enjekte .
16. Gaz Oranı Kütle Spektrometresi (ThermoQuest Finnigan Delta Plus) tarafından "çözünmüş CO ₂ örnekleri" analiz edin.

Protokol D. İşleme Protokolleri amino asit ve gaz kromatografisi / kütle spektrometresi ile organik asit analizi için A ve B numuneleri nötralize etti.

1. Boncuk Hazırlanışı:
   1. Ag 1 ve 1L bardak ayrı Ag 50 boncuk 1 N HCl ekleyin.
   2. Her balona manyetik karıştırıcı ile 30 dakika boyunca karıştırın.
   3. Yıkamalar pH pH suyun eşit oluncaya kadar 10 kez boncuk deiyonize su ile yıkayın.
2. Sütun Hazırlanışı:
   1. Pasteur pipet ucu dar parçası üzerinde bir pamuk takın.
   2. Kolon yüksekliği yaklaşık üçte biri her bir dolum, her iki sütun örnek başına ücret boncuk ekleyin. Organik asit ekstraksiyonu için AG1 boncuk kullanın. Amino asit ekstraksiyonu için AG50 boncuk kullanın.
3. Örnek İşleme:
   1. Örnek 500 mcL ücret AG1 boncuk sütun ekleyin. Örnek nötr pH zaten ayıklamak için, organik asitler AG1 sütun uygulamadan önce hiçbir şey (PROTOKOLÜ A, adım # 19B) örnek eklenir.
   2. 1 mL 0.1 N HCL amino asitler ayıklamak için AG50 sütun uygulamadan önce kalan örnek ekleyin.
   3. Örnekleri kolonları vasıtası ile tamamen çalıştırmak için izin verin.
   4. Yıkamalar nötr (pH 7-8 aralığı) kadar su 10 kez sütun yıkayın.
   5. Taze, etiketli cam 4 mL numune şişeleri sütunlar Zehir:
      1. Organik Asit çıkarma için, AG1 sütun 3 N HCl 3ml ekleyin. , 3-karbon türleri (laktat), 4-karbon türleri (aspartat, süksinat, malat) arasında toplam sayısı etiketli karbonlar izotop zenginleştirme analizi izin5-karbon türleri (glutamat) ve 6-karbon türleri (sitrat).
      2. Amino asit ekstraksiyonu için: 4 N NH ₄ OH 3ml AG50 sütun eklemek. Bu, 3-karbon türleri (alanin) ve 5-karbon türleri (glutamin) arasında toplam sayısı etiketli karbonlar izotop zenginleştirme analizi izin verir.
   6. Kuruyana kadar geceleme Reacti Vap III Evaporatör numune şişeleri yerleştirin.

Kütle Spektrometresi E. Örnek Derivitization ve Makine Ayarları

Her bir örnek şişesine 50 mcL asetonitril ve N-metil-nt-butyldimethylsilyl trifluoroacetamide (MTBSTFA) 50 mcL ekleyin. , Kapak, karıştırın ve 60 ° C'de 30 dakika inkübe Gaz Kromatografisi / Kütle Spektrometresi (GC / MS) başına 1-2 ul örnek enjekte edilir.

F. Sonuçlarının Analizi

1. Amino asit doruklarına Niceleme. HPLC analizi ile her bir amino asit kantitasyonu her tepe noktası göreli iç standart alanını kullanarak hesaplanır.
2. Izotopik zenginleştirme hesaplanıyor. Kararlı izotop zenginleşmesine göre her tür için Excel'in (Microsoft) hesaplanır aşağıdaki formül: Atom Yüzde Fazla, düzeltilmiş (APE) = (R _{sa-R st)} * 100 / _{[(Ar-sa-R st)} 100] _Ar-sa - Örnek ve _Ar-st Oranı standart oranı.
3. Numune zenginleştirme arasında istatistiksel olarak farklılık değerlendirilmesi. Student t-testi, göreli amino asit ve izotopik etiket örnekler arasında farklılıklar önemini değerlendirmek için kullanılır.

TEMSİLCİSİ SONUÇLAR:

Kararlı izotop etiketli karbon atmosferdeki CO ₂ ve çözünmüş solucan CO 2 olarak ölçülen kanıtladığı gibi, genç erişkin solucanlar içine iyi kurulmuştur. Solucanlar beslenen yaşayan ya da UV-ışınlanmış ya OP50 E. öldürdü coli, ¹³ CO _{2 ila} ¹² CO ₂ oranının, serbest atmosferdeki CO ₂ (Şekil 1) göre, çözünmüş _solucan CO 2 fraksiyonu daha fazlaydı. Besleme solucanlar OP50 E. canlı veya öldürdü coli önemli ölçüde yıkanmış solucan ekstraktı (PROTOKOL C1) ölçülen ¹³ CO _{2 ila} ¹² CO ₂ oranı değiştirmek vermedi.

Erken larva döneminden stabil izotop uzun süre maruz kalmak, izotopik zenginleştirme aracı metabolitleri arttı. Solucanlar beslenen genç erişkin yabani tip solucanlar ara metabolit tespit etiketli karbon düzeltildi Atomlar Yüzde Aşırı glutamat türler arasında büyük evrensel etiketli ¹³ C-glikoz ve benzer şekilde tedavi edilen hayvanlar için canlı bakteri gelişimi boyunca 48 etiketli bakteri beslenen saat sadece yumurtlama yetişkin evre (Şekil 2) ulaştıktan sonra.

Izotopik zenginleştirme kez temizleme etkisi. Plakalar üzerinde yetiştirilen bütün hayvanlar maruz timecourse ne olursa olsun, GC / MS analizleri için aşağı hazırlanması öncesinde izotopik etiket 'temizlendi'. Şekil 2'de gösterildiği gibi takas protokolleri karşılaştırılması yapıldı, 2 saat boyunca bakteri olmadan NGM agar plaklarına izotop ya da yem olmadan canlı, taze bakteri ile yayılır NGM agar plaklarına 2 saat için solucanlar beslenme ve bakteri olmadan NGM agar plaklarına beslenme de dahil olmak üzere, ya 2 ya da 6 saat. Hayvanlar 2 ya da 6 saat ya da bakteriler olmadan plakalar temizlendi izotopik maruz dersin ne olursa olsun, genç yetişkin tüm solucan özü izotopik zenginleştirme aracı metabolitleri açısından anlamlı bir fark gözlendi. Hayvanlar, daha sonra iki saat boyunca etiketsiz bakteri beslenen fazla izotopun 'temizlenir' Buna karşılık, daha az izotopik zenginleştirme aracı metabolitleri gözlendi. Ancak, +4, +3 zenginleştirme artış ve solucanlar erken larva döneminden izotop maruz kaldılar 5 türler belliydi. Bu nedenle, optimal takas protokolü unspread NGM plakaları 2 saat sonraki kuluçka stabil izotop ve bakteri yayılmasını NGM plakaları, inkübasyon solucanlar temizleyerek tespit edildi. Unutmayın ki, sıvı kültüründe yetişen solucanlar S. bazal üç cilt olarak izotopik etiket ve bakteriler (Protokol B) açık yıkandı; yıkamalar GC / MS analizi, üçüncü yıkama anlamlı izotopik zenginleştirme gösterdi.

Solucan taşlama aracı metabolitleri maksimal zenginleştirme vermiştir. Benzer tedavi koşulları aşağıdaki ara metabolit yüzde zenginleştirme optimize etmek için karşılaştırma, tek başına sonication veya sonication artı taşlama kesintiye solucan örnekleri yapıldı. Solucanlar sonication tarafından aşağıdaki izotop kesintiye maruz artı sadece sonication tarafından kesintiye örnekleri daha fazla izotop zenginleştirme vardı taşlama Şekil 3 gösterir. Bu veriler, daha fazla alt-organizma fraksiyonları sonication daha taşlama tarafından kesintiye olduğunu düşündürmektedir. Daha sonraki çalışmalarda sonicatio olmadan tek başına taşlama ortayan maksimum izotopik zenginleştirme (veriler gösterilmemiştir) elde etmek için yeterli oldu.

Tüm solucan izotopik maruz aracı metabolik yolu akı analizi izin verir. Ya stabil izotop habercisi yetişkin aşamada hayvanlarda geliştirme (PROTOKOLÜ A, Şekil 4A) veya başlarında yaşayan solucanlar Besleme (PROTOKOLÜ B, Şekil 4B), hassas analizi (laktat, alanin), piruvat glikoliz yoluyla akı göstergesidir metabolitleri arasında izotopik zenginleştirme izin metabolizma (alanin) ve trikarboksilik asit döngüsü (sitrat, malat, süksinat, aspartat, glutamat ve glutamin). Evrensel etiketli ¹³ C-glikoz 1,6, kullanımı ise, tüm karbon türlerin sağlam bir etiket - ¹³ C _2-glukoz sadece +1 her metaboliti tür sağlam etiketleme izin verir. Bu teknik hassas karmaşık III mitokondriyal solunum zinciri altbirim mutant isp-1 (qm150) gibi yabani tip solucan aracı metabolik akı farklılıklar, mitokondriyal solunum zinciri mutant suşların ayırt edebilirsiniz. K12 E. ile ¹³ C sıvı kültür _2-glukoz Şekil 5 mutlak etiket isp-1 (qm150) ve N2 solucanlar her biri 1,6 için 24 saat boyunca maruz arasında gözlenen farklılıklar büyüklüğünü göstermektedir. ilk günden itibaren coli bakteri yumurta döşeme genç yetişkinlik evresi (Protokol B). Mitokondriyal mutant solucanlar bir dizi ek kararlı izotop çalışmaları devam etmektedir.

Şekil 1. Evrensel etiketli ¹³ C-glikoz stabil izotop genç erişkin solucanlar içine dahil oldu ¹³ CO _2: ¹² CO ₂ besleme iki saat sonra yabani tip (N2) solucanlar evrensel oranı (yüzde aşan atomların (APE), düzeltilmiş) C solucan metabolitleri içine dahil izotop maruz kalma iki saat sonra ¹³ C-glikoz ve ya UV-öldürülen veya levhalar (PROTOKOL C1) OP50 bakterilerin yaşaması ¹³ etiketli sağlam oldu. Mavi ve kırmızı çubuklar sırasıyla gaz fazında göreceli izotop zenginleştirme ("atmosferik CO ₂₎ ve sıvı faz (" solucan CO ₂ "), göstermektedir.

Şekil 2. Uzun süreli izotop erken larva döneminde maruz kalma ve daha sonra bakteri olmadan NGM agar plaklarına solucanlar 'takas' genç erişkin solucanlar serbest glutamat izotopik zenginleştirme arttı. Glutamat türlerin İzotopik zenginleştirme NGM agar plaklarına beslenen solucanlar için gösterilen evrensel-etiketli ¹³ C-glikoz ve ya 959 hücre genç erişkin aşamasında L1 larva dönemi gelişimi boyunca ("L1", PROTOKOL A) OP50 bakteri ya da kırk sekiz saat için solucanlar ilk gününde ulaştığında başında yumurtlama genç yetişkin aşamasında ("YA"). X-ekseni her glutamat türlerin etiketli karbon atomlarının toplam sayısını gösterir. Y-ekseni yüzde zenginleştirme (aşırı başına düzeltilmiş atomlar (APE)) gösterir. Yeşil bar solucanlar OP50 E. besleyen aşağıdaki izotop maruz temizledi PCA çıkarma iki saat önce NGM plakaları izotop olmadan coli. Mavi ve gri çubuklar solucanlar PCA çıkarma önce, sırasıyla, iki ya da altı saat boyunca bakteri veya izotop olmadan NGM plakalar üzerinde aşağıdaki izotop maruz temizledi göstermektedir.

Şekil 3. Verimi maksimum izotopik zenginleştirme aracı solucan metabolitleri taşlama ile solucanlar bozmak. Yüzde ¹³ C _2-glukoz bakteriler (PROTOKOLÜ B) olmadan 1,6 ile 24 saat boyunca sıvı kültüründe tedavi edilen yabani tip solucan +1 sitrat türlerin ölçülen karbon zenginleştirme . Siyah ve gri çubuklar sırasıyla sonication sadece sonication tarafından bozulur ve taşlama solucanlar göstermektedir. 1,6 maruz izotopik zenginleştirme - ¹³ C _2-glukoz iyi bir karbon etiketli metabolitleri değerlendirilir. Buna karşın, evrensel ^etiketli-13 C-glikoz kullanılmaktadır etiket her metaboliti bütün türlerin zenginleştirilmiştir.

Şekil 4. Temsilcisi sonuçları glikoliz, pirüvat metabolizma ve trikarboksilik asit döngüsü ile akı göstergesidir solucan ara metabolit izotopik zenginleştirme ölçüde göstermektedir. Düzeltildi atomların yüzde fazlalık (APE), genç erişkin 1 wild-tip (N2 Bristol) solucanları tespit edildi 6 - ¹³ ya (A) levhalar (PROTOKOL), L1 aşamasından geliştirme sırasında veya (B) başında ilk gününde C _2-glukoz maruz yumurtlama (PROTOKOLÜ B) genç yetişkinler olarak 24 saat boyunca sıvı kültüründe . Hata çubukları, biyolojik çoğaltır üç güvenilir izotopik veriler mevcuttur standart sapma gösterir.

Şekil 5. Mutlak amino asit amino asit metabolit türlerin yabani tip ve mutant mitokondrial solucan suşları kantitatif. Dört amino asitlerin her tür Mutlak etiket çarpılarak hesaplanır HPLC-düzeltilmiş atomların yüzde fazlalık (APE) tarafından belirlenen her tür için serbest amino asit konsantrasyonu (solucan nmol / mg protein). Gri ve siyah çubuklar sırasıyla, wild-tip (isp-1 (qm150)) (N2 Bristol) ve mitokondriyal karmaşık III altbirim mutant göstermektedir. Barlar ortalama gerilme başına üç çoğaltmak biyolojik deneyler gösteriyor.

Tartışmalar

Izotopik bolluk aracı metabolitleri ölçmek için kütle spektrometresi uygulanması kritik biyokimyasal değişiklikler ⁵ harika detaylı bir resmini tanıyor. Burada, genetik olarak çok yönlü bir model hayvan, C. aracılık metabolik akı değerlendirmek için bu son derece duyarlı ve özgül bir metodoloji istismar için ayrıntılı protokolleri sağladı elegans. Gerçekten de, stabil izotop ile yaşayan hayvanların beslenmesi aşağı metabolitleri izotopik zenginleştirme ölçerken metabolik öncüleri (örneğin, ^C-13 glukoz gibi) aracı metabolik yolu akı içine roman fikir izin etiketli. Glikoliz, pirüvat metabolizma ve trikarboksilik asit döngüsü ile akı sağlam analiz elde etmek için güvenilir bir yöntem geliştirdi. Bu erken larval gelişim evreleri stabil izotop beslenen hayvanlarda ya da post-mitotik yetişkin dönemde başlayan hem de elde edilebilir. Ücretsiz solucan alanin, aspartat, glutamat ve glutamin farklı türlerin mutlak izotopik zenginleştirme önceden belirlemek için, ⁴ açıklandığı gibi farklı metabolit türlerin izotopik zenginleştirme, yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile tüm solucan serbest amino asit profili ile birlikte okudu. Gerçekten de, 1.000 ila 2.000 genç erişkin senkron solucanları hacimde, amino asit ve organik asit analitlerin ölçerken izotopik zenginleştirme tutarlı desenler elde edilir. Böyle bir metodoloji, hassas, yabani tip solucanlar göre nükleer gen tabanlı mitokondriyal mutant anormal aracı akı ayrımcılık.

Bu teknik uygunluğu belirli biyokimyasal yollar sık ​​görülen doğumsal metabolizma akı değişiklikleri araştırmak için değeri tutar. Özellikle, stabil izotop ile işaretlenmiş glikoz kullanımını mitokondrial hastalığı ile ilgili merkezi metabolik yollar aracılığıyla karbon akı bilgilendirir. Gerçekten de, bizim böyle bir metodolojinin uygulama hassas yabani tip solucanlar göreceli bir nükleer gen tabanlı mitokondriyal karmaşık III altbirim mutant suş (isp-1 (qm150)) anormal aracı akı ayrımcılık öneririz.

Izotopik maruz kalma birkaç gün bir süre içinde tamamlanmış olduğundan, hücre tabanlı modeller belirlenecek gibi sayısal izotopik zenginleştirme zaman belirli bir süre boyunca "kararlı durum" zenginleştirme değeri yerine ölçülebilir akı temsil ettiğini kabul etmek önemlidir. saat dakika bir süre için izotop maruz. Yolağı akı nematod gelişimi boyunca sorguya başka potansiyel sınırlama özellikle mutant suşların ortaya çıkan larva gelişimini uzunlukları farklı ilgilidir. Örneğin, birçok ciddi mitokondriyal mutasyonlar üçüncü (L3) larva dönemi ⁶ tutuklama neden olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, sadece yetişkinliğe hayatta hayvanlar izotop esas analizi tüm mutant nüfusunun temsilcisi olmayabilir. Ancak, bu yöntem belirli bir larva dönemi (L2) ziyade hayvanlar yetişkin aşamaya ulaşmak için bekleyen aracı metabolitleri izotopik dahil değerlendirmek için adapte edilebilir. Benzer şekilde, büyük olasılıkla Dauer olarak bilinen alternatif larva dönemi girin hayvanların önemli ölçüde doğrudan dört larval aşamalardan geçerek devam hayvanlara göre (büyük olasılıkla daha düşük) metabolik akı değiştirmiştir. Gelecek çalışma aynı zamanda doğrudan Dauer sahne hayvanlarda farklı genetik geçmişleri izotopik birleştirmek değerlendirmek için yapılabilir. Hayvanlar genç yetişkin aşamasına ulaştıktan sonra başlayan sabit bir süre için (burada, 24 ila 48 saat) stabil izotop hayvanların maruz kalması (Protokol B ayrıntılı olarak) değişken gelişim dönemlerinin etkisi ortadan kaldırır. ¹³ C-glikoz glikoliz, pirüvat metabolizma ve trikarboksilik asit döngüsü akı sorguluyor, diğer izotop izleyiciler nematod ilgi diğer yollar aracılığıyla biyokimyasal yol akı sorgulamak için potansiyel değerlendirilecektir olabilir. Örneğin, ¹⁵ N-glisin amino asit cirosu nematod olarak değerlendirmek için kullanılabilir olabilir.

Bu yaklaşımın bir başka potansiyel sınırlama metaboliti algılama hassasiyet seviyesi. Deneyimlerimiz, en az 500 genç erişkin nematod burada istihdam edilen HPLC ve GC / MS yöntemleri başarıyla izotopik birleştirmek ölçmek için gerekli göstermektedir. Ultra performanslı sıvı kromatografi (UPLC) gibi yüksek hassasiyette, enstrümanların kullanımı, biz bu tek solucanlar metaboliti olan türler içine metabolitleri ve izotopik dahil güvenilir kantitatif izin olası tahmin rağmen, çalışılan hayvan sayısının daha da azalmasına izin verebilir. Biz, biz her bir suş düşük bolluk metabolitleri güvenilir bir şekilde tespit etmek için deney başına 1.000 hayvanların solucan popülasyonları okudu. Ancak, böyle bir GABA gibi bazı metabolitleri, sadece güvenilir, sipariş üzerine, nematod nüfusları çok daha büyük sayısal olabilir1x10 ⁶ hayvanların ^4.

Özet olarak, stabil izotop profili doğuştan metabolizma uzun çalışma için kullanılan bir non-invaziv ve güvenli (radyoaktif olmayan) bir yaklaşım sağlar. Bu metodoloji C. Uygulama elegans bireysel genetik bozukluklar ve / veya farmakolojik ajan maruz kalma sonucu in vivo, gerçek zamanlı, tüm hayvan seviyesinde meydana gelen metabolik değişiklikler, araştırmak için roman kapasiteli sağlar .

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
S. basal		1 - page 59	Protocols A and B
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-8503	Protocol B
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protocols A and C
K12 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protocol B
NGM agar	Research Products International Corp.	N81800-1000.0	Protocols A, B, and C
13C glucose (universally labeled)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-1396	Protocol A and C
13C glucose (1,6 labeled)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-2717	Protocol B
60% Perchloric acid (PCA)	Fisher Scientific	MK2766500	Protocols A and B
ε-aminocaproic acid (Internal Standard)	Sigma-Aldrich	A-2504	Protocols A and B
MTBSTFA	Regis	270243	Protocol E
Acetonitrile	Regis	270010	Protocol E
AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin	Bio-Rad	140-1441	Protocols A and B (organic acid extraction)
AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin	Bio-Rad	142-1441	Protocols A and B (amino acid extraction)
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S-8875	Protocol C
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045	Protocol C
3N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol D
1N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol A
0.1 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol D
4N NH4OH	Sigma-Aldrich	30501	Protocol D
4N KOH	Sigma-Aldrich	484016	Protocols A and B
Deionized water	Milli Q Biocel	ZMQA60F01	Protocol D
Helium	Airgas	24001364	Protocol C2
SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope	Nikon Instruments	NI MNA41000	Protocols A, B, and C
pH meter	Fisher Scientific	S68167	Protocols A and B
Table top centrifuge - 5804R	Eppendorf	05-400-93	Protocols A and B
Incubated platform shaker	New Brunswick Scientific	M1324-0004	Protocol B
Mini LabRoller Rotator	Labnet International	H-5500	Protocols A and B
Pestles	Kontes Corp	K749520-0090	Protocols A and B
Drill	Kontes Corp	K749540-0000	Protocols A and B
1 L glass beaker	Fisher Scientific	02-539P
1 L Erlenmeyer Flasks	VWR international	89000-368
25 mL Erlenmeyer Flasks	VWR international	89000-356	Protocol B
7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper	VWR international	VT6431	Protocols A, B, and C1,C2
10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper	VWR international	VT6430	Protocol C2
Blue top tubes	Labco	438B
50 ml conical plastic tubes	Falcon BD	14-959-49A	All protocols
1.5 ml microfuge tubes	Fisher Scientific	02-681-320	Protocols A and B
Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL)	BD Biosciences	301025, 301029, 301031	Protocols C1 and C2
25 gauge needles	Fisher Scientific	22-253-131	Protocols C1 and C2
Poly-Prep Chromatography Columns	Bio-Rad	731-1550	Protocol D
Pasteur pipettes	VWR international	14673-043	Protocol D
60mm Petri dishes	VWR international	25373-085	Protocol C
Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock	Custom Made		Protocol C
Optically transparent glass plate	Custom Made		Protocol C
Reacti-Vap III Evaporator	Thermo Fisher Scientific, Inc.	18826	Protocol D
Cotton	VWR international	14224-516	Protocol D
High Vacuum Grease	Dow Corning	1597418	Protocol C1
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-18	Protocol B
Timer	ISC Bioexpress	T-2504-5	Protocol C
Gas-Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Inc.		Protocol D
GC-MS	Hewlett-Packard	5980/5971	Protocol D
GC-MS	Agilent Technologies	6980N/5973N	Protocol D
HPLC	Varian Inc., Agilent	9010	Protocol D