Lökotrien B Gerçek zamanlı görüntüleme 4 Hücre aracılığı ile Göç ve β-arrestin BLT1 Etkileşimleri

Özet

Bu yazıda, özel ligandlar lökositlerin kemotaktik yanıt belirlemek ve hücre yüzey reseptörleri ve sitozolik proteinler canlı hücre görüntüleme teknikleri kullanarak arasındaki etkileşimleri tanımlamak için metodolojiyi tanımlamaktadır.

Özet

G-protein reseptörler (GPCRs) yedi transmembran protein ailesine ait olan ve hücre içi yanıtları ekstraselüler sinyallerin transdüksiyon arabuluculuk. GPCRs kontrolü gibi kemotaksis gibi çok çeşitli biyolojik fonksiyonları, hücre içi kalsiyum salınımını, ligand bağımlı bir şekilde heterotrimeric ^{G-proteinleri} 1-2 ile gen regülasyonu . Ligand bağlanması, siklik adenozin monofosfat (cAMP), inositol trifosfat (IP3) ve diacyl gliserol (DG) gibi ikinci haberciler düzeyleri modüle heterotrimeric G-proteinleri aktivasyonu önde gelen yapı değişiklikleri bir dizi neden olur. Reseptör ligand bağlama aktivasyonu ile eş zamanlı, aynı zamanda, duyarsızlaştırma, haciz ve / veya içselleştirilmesi yoluyla sinyalizasyon reseptör azaltmak için bir dizi etkinlik başlatır. GPCRs duyarsızlaştırma süreci, G-protein reseptör kinazlar (GRKs) ve ^β-arrestins 3 sonraki bağlanma reseptör fosforilasyon yoluyla oluşur . β-arrestins sitozolik proteinleri ve reseptör içselleştirilmesi ^4-6 kolaylaştırarak var (çoğu durumda) fosforile reseptörlerine bağlanarak GPCR aktivasyon üzerine membran yerini değiştirmek.

Ve LTB ₄ reseptörü 2 (BLT2; düşük afinitesi reseptör; lökotrien B ₄ (LTB _4), araşidonik asit yolağı ve aracılık eylemleri GPCRs, _LTB 4 reseptörü 1 (afinitesi yüksek bir reseptörün BLT1) yoluyla elde edilen bir pro-inflamatuar lipid molekülünün . ) ^7-9. LTB _4-BLT1 yolağı, astım, artrit ve ^ateroskleroz 10-17 dahil olmak üzere birçok iltihabi hastalıklar kritik olduğu gösterilmiştir . Geçerli kağıt LTB _4-kaynaklı lökosit göçü ve BLT1 etkileşimler ile β-arrestin ve mikroskopi görüntüleme teknikleri kullanılarak ^18-19 canlı hücrelerde reseptör translokasyon izlemek için geliştirilen metodolojileri açıklanmaktadır.

Kemik iliği elde edilen C57BL / 6 farelerinde dendritik hücreler izole edilmiş ve daha önce ^20-21 açıklandığı gibi kültüre edildi. Bu hücreler, canlı hücre görüntüleme yöntemleri _LTB 4 indüklenen hücre göçü göstermek için test edildi . Insan BLT1 yeşil floresan protein (β-dizi-GFP) ile etiketlenen C-terminalindeki ve β-arrestin1 kırmızı floresan proteini (BLT1 RFP) etiketli ve Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) hücre hatları her iki plazmid transfekte ^18-19. Bu proteinler ve yerelleştirme arasındaki etkileşimin kinetiği canlı hücre video mikroskopi kullanılarak takip edildi. Geçerli kağıt metodolojileri, canlı hücrelerin G-protein reseptörler fonksiyonel yanıtları incelemektir mikroskobik teknikler kullandıklarını açıklarlar. Reseptör kinetiği ve sitozolik protein etkileşimleri belirlemek için floresan yoğunlukları ölçmek için de geçerli kağıt Metamorph yazılım kullanımını açıklar.

Protokol

Metodoloji

Mikroskop açıklaması

Eclipse TE300 Nikon Ters Mikroskop bağlı TE-FM Epi-Floresan sistemi kullanılarak yapılan canlı hücre görüntüleme deneyleri. Mikroskop ısıtma sahne ile donatılmıştır. Serin bir ek bileşenini HD dijital / B CCD (Roper Bilimsel) kamera ve LAMDA 10-2 optik filtre değiştirici (Sutter aracı şirket) mikroskop eklenir. Uyarma ve emisyon dalga boylarında filtre çarklarını kontrollü ve Lamba 10-2 filtre çarkı denetleyici tarafından kontrol edilir, Sutter Aletleri Co Pozlama süresi 500 ms canlı hücrelerde RFP veya GFP görüntülemek için yeterli olmalıdır. Donanım kontrolü ve görüntülerin elde edilmesi Metamorph yazılımı tarafından kontrol edilir. EGFP / DsRed çift renk değişikliği, Krom Teknoloji Bu çalışmada filtreleri seçim, filtre S480/20x, S525/40m ve S565/25x, GFP ve RFP S620/60m sırasıyla setleri. Bu filtre, tekerlek altı filtre setleri kapasitelidir. Mikroskop Joy sopayla önce ProScan sahne denetleyicisi ile eklenir. Tüm bu donanım ekler Metamorph yazılım tarafından kontrol edilebilir. Mikroskop mikropipetler tutmak için mikromanipülatörler ile eklenir.

A. Ölçüm Lökotrien B ₄ Yönetmen Dendritik Hücre Göç

Yukarıda açıklanan mikroskop ayarını kullanarak, biz, gerçek zamanlı olarak ligand yönettiği dendritik hücre göçü takip etmek için yöntemler geliştirdi. İki mikromanipülatörler (Narishige) mikroskop bağlı. LTB ₄ degrade doğru dendritik hücreler (BMDCs) elde edilen fare kemik iliği kemotaksis kaydedildi. Burada, biz, mikro-pipet içine ligand yükleme ve hücre yönlü göç izlemek için mikroskobun ısıtılmış sahnede kemotaksis deney kurma, mikro-pipet çektirmesi kullanarak mikro-pipetler hazırlamak için yöntemleri açıklanmaktadır. Bu yöntem, göçün yanı sıra canlı hücrelerde kemotaksis inhibitörleri etkisi inducing farklı chemoattractants etkinliğini test etmek için uygulanabilir. Jüpiter ²² dahil olmak üzere çeşitli yayınlarda fare BMDCs ²¹ izolasyonu tarif edilmiştir.

1. BMDCs, hazırlanması

1. Kapak kayma alt Fluoro çanak ve onları 16 saat öncesinde deney için büyümeye izin BMDCs Plate (10 gün kültürleme sonra).
2. 1X PBS 3 mL en az 2 kez (plaka 1X PBS 3 ml ekleyerek ve tampon dışarı aspire) ile hücrelerin yıkayın.
3. Plaka 1XPBS 2 mL ekleyin. Hücreleri deney için hazır. 37 ° C inkübatör önce deneme için hücrelerin tutun.

Ligand yüklü mikro pipet hazırlanması:

4. Dikey mikropipet çektirmesi (Narishige International USA, Inc.), Kılcal cam tüpler (6 ", Kedi # 625.500, Sistemleri A.Ş. Cam standart, 0.75 mm x 0.4 mm) sabitleyin.
5. 52 yaşındayken sıcaklık ° C ve cam, keskin kenar ipuçları oluşturacak şekilde eritebilir ve apart çekmek için izin tutun.
6. Pipet mikro pipet tutucu üzerine sabitleyin.
7. M-900 (Narishige International USA, Inc.) Mikroskop altında seyrederek Micro sahte mikro pipet kullanarak pürüzlü kenarlar pürüzsüz.
8. Her bir deney için en az 10-20 pipetler hazırlayın. Not: mikropipetler Dünya Hassas Aletler (μ TIP, T1801TW1F) satın alınabilir.
9. Ligand istenen konsantrasyon (500 mcL deneyde 100 nM LTB ₄₎ 1 ml effendorf tüpe alın ve çözüm mikro pipet tutmak ve çözüm mikro pipet (dolum) girmek için izin verin .
10. 1 ml ligand ve şırınga (1 cc tüberkülin şırınga) içine alın ve yavaş yavaş üst mikro pipet içine doldurun Mikro-iğne (MF 28G-5, Dünya Hassas Aletler) kullanarak ligand doldurun.
11. Boru, ligand ile doludur 1 ml şırınga, iğne (21 G 11 / 2), pipet ve tüp pipet sıkıca bağlayın.
12. Şimdi, mikro manipülatörler üzerine mikroskop sahne ve düzeltmek için mikro-pipet dolu ligand dikkatli bir şekilde hareket ettirin.
13. , Emin ligand ucundan yavaş yavaş serbest olmak için şırınga az basınç uygulayın.
14. Mikroskop kaplama olgunlaşmamış BMDCs getirin ve ısıtmalı plaka (37 ° C) evre onları tutmak.
15. Floro çanak kapağı çıkarın.
16. Immersiyon yağı 60X objektif lens kullanarak hücrelerin odaklanın.
17. Dikkatle, pipet hücrelerin yakınlığı 'Kaba Kılavuzu Manipulator MN-188NE kullanarak yüklü ligand aşağı getirmek.
18. 'Hidrolik Güzel Mikromanipülatör MN-188 KD' pipet kullanarak odaklanın.
19. Ligand çanak içine serbest olduğundan emin olmak için şırınga az basınç uygulayın.
20. Elde etmek için görüntü toplama parametreleri ayarlayın parlak Metamorph yazılım kullanarak 2 saat için her 15 saniyede (10 ms maruz) yayınlandı.
21. Pr için her 30 dakikada bir izlemeligand doğru göç ogression.
22. Pipet ucu hücreleri de kalabalık iseniz, deney göç devam plakasını ucunun konumunu değiştirmek.

B. Ölçüm GPCR (BLT1) ve Sitosolik Protein (β-arrestin) etkileşmeleri, Canlı Hücrelerde Translokasyon

1. Plazmid DNA oluşturur hazırlanması

Jala'dan ve ark (2005) ¹⁸ DNA plazmid yapıları detayları tarif edildi.

2. İnsan BLT1 RFP ve β-Arrestin-GFP RBL-2H3 Hücreler içine Transfeksiyon

1. Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) 37 Hücreleri (60 ila 70% izdiham) ° C% 95 hava nemlendirilmiş bir atmosferde,% 5 CO ₂ büyüme medyada tek tabaka kültürler (DMEM% 15 FBS, 2 ile desteklenmiş olarak koruyun mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin ve T75 matara 100 mg / ml streptomisin).
2. 6 ml tripsin-EDTA (% 0.05 tripsin, 0.53 mM EDTA) kullanılarak ve 37 az 5 dakika boyunca inkübe çanak / şişeler hücreler Ayır ° C,% 95 hava nemlendirilmiş bir atmosferde% 5 CO _2. Hücrelerin dekolmanı ölçüde izlemek için matara yavaşça sallayın.
3. 6 büyüme medya mL balona 6 ml tripsin-EDTA içeren ve birden çok kez yukarı aşağı pipetleme karıştırarak hücreleri toplamak. 15 ml şahin tüpler içine hücreleri aktarın.
4. Hemasitometre kullanarak hücre sayımı ve 4 x 10 ⁶ hücre, 200 transfeksiyon medya mcL 3 dakika ve tekrar süspansiyon için 480g rpm (DMEM,% 20 FBS, 50 mM HEPES) 15 ml santrifüj tüpleri ve santrifüj . 3 transfections gerçekleştirmeyi planlıyorsanız, artan hücre sayısı ve hacim transfeksiyon orta hücreleri ve tranfection medya buna göre hazırlamak.
5. En az 1.5 mg / ml konsantrasyonlarda transfekte plazmid hazırlayın. Biz QIAGEN Maxi DNA plazmid kiti kullanılarak plazmid DNA hazırlıyoruz. 0.4 cm elektrot boşluk steril elektroforez küvetler, (Bio-Rad # 16.552.088), bireysel ya da insan BLT1-RFP (25 mikrogram) ve β-arrestin1-GFP (15 mikrogram) için hem de plazmid DNA'lar kodlama ekleyin.
6. Yukarıdaki yeniden süspanse hücre 200 mcL alın ve hBLT1-RFP veya β-arrestin1-GFP veya her ikisini birlikte ya içeren küvetler koyun ve 1 ml steril bir pipet yardımıyla hafifçe karıştırın.
7. 10 dakika oda sıcaklığında yukarıdaki küvetler bırakın.
8. Gene Verici II hücreleri voltajı 250 v ve kapasitesi 500 μF Electroporate.
9. Elektroporasyon sonra hücreler 10 dakika süreyle oda sıcaklığında kalmasına izin.
10. Düzenli büyüme orta 1 mL alın ve küvetleri electroporated hücreleri ile karıştırın.
11. Bu karışımı,% 5 CO 2 ml normal büyüme medya içeren 35 mm doku cam alt kültür kaplarına (Fluoro çanak, Dünya Hassas Aletler) 300 mcL dağıtın ve 1 saat boyunca inkübe 37 ° C'de% 95 hava nemlendirilmiş bir atmosferde. _2. Hücreleri çanak alt uymak için izin ver.
12. Düzenli büyüme medya ile 1 saat sonra inkübasyon ortamı değiştirin ve bunları 37 büyümeye izin ° C,% 95 hava nemlendirilmiş bir atmosferde 18-24 saat için% 5 CO ₂ inkübatör.

3. Canlı Hücre Görüntüleme

Görüntülerin elde edilmesi

1. 18-24 saat sonra, 10 mM HEPES, pH 7.55 (plaka ve aspirat medya doğrudan sıcak medya 2 mL ekleyin. 2 veya 3 kez tekrarlayın) içeren 2 ml sıcak fenol kırmızısı ücretsiz RPMI hücreleri 2 veya 3 kere yıkayın. 1.8 ml 10 mM HEPES içeren sıcak fenol kırmızısı ücretsiz RPMI ekleyin.
2. HBLT1 RFP ve ısıtmalı mikroskop sahnede β-arrestin1-GFP (37 ° C) ile transfekte RBL-2H3 hücreleri içeren Yeri 30 mm cam lamel oturaklı kültür yemekleri.
3. 600x büyütme 60 X objektif Nikon Planı Apo 60X/1.4 sayısal diyafram immersiyon yağı lens (mikroskop sistemi mevcuttur) kullanarak hücre görüntüleri toplayın.
4. 60 x amacı lens üzerinde bir yağ damlası koyun ve odak düzenli parlak bir alan hücreler, plakanın alt dokunarak ışık iletilir.
5. Transfekte proteinlerin floresan, floresan filtre (RFP filtresi, β-arrestin1 görmek istiyorsanız, reseptör veya GFP görmek istiyorsanız), parlak bir alan (iletilen ışık) geçiş izlemek için.
6. Parlak ve sağlıklı hücre, hücre yüzeyinde RFP filtre ve görüntü yakalama kullanarak hBLT1 RFP ifade seçin.
7. Sonra GFP filtre kayması ve β-arrestin-GFP sitoplazma ifade emin olun ve görüntü yakalama. Sonra sözde hem renkli hem de görüntü yakalama zaman floresan ile kanama RFP ve GFP arasında meydana gelen almayan olduğunu emin olmak için, canlı hücre görüntüler lapsed önce.
8. Cep seçim sonra, yazılımı kullanarak amacınıza (bu örnekte Metamorph Yazılımı) göre parametrelerini ayarlamak.
9. Mevcut gösteri, onaltı bit görüntüleri geldi ile elde edilenra binning 1 set X 1 60 X objektif Nikon Planı Apo 60X/1.4 sayısal diyafram immersiyon yağı lens ile birlikte.
10. Metamorph yazılım tarafından kontrol edilen bu kullanıyorsanız filtre çarklarını 30 saniye zaman aralığı (translokasyon / etkileşim çok hızlı ise, bir zaman aralıklarında azaltabilir) aynı anda RFP ve GFP fluorochromes için floresan görüntüleri toplayın.
11. Kamera pozlama süreleri RFP ve GFP 1000 msn ayarlayın. (GFP RFP ve floresan yoğunluğuna göre özel maruz kalma sürelerini ayarlama).
12. İlk 1 dakika için 0 noktası olarak hizmet vermektedir ekleyerek ligand olmadan görüntüleri toplamak.
13. 1 dakika sonra plaka / veya hücre konumunu bozmadan ligand 200 mcL (10 mcM stok 1 mcM bir final konsantrasyon) ekleyin.
14. Ligand ekledikten sonra 60 dakika floresan görüntülerin dosya adlarının artan sipariş ile toplanır ve TIFF görüntüleri olarak depolanır.
15. Tüm bu dosyaları yazılım kullanarak zaman damgaları ile bireysel / kombine floresan görüntüler yığını dosyaları olarak yapılabilir.

Süreci ve floresan proteinleri ve yerelleştirme ölçümü görüntüleri

1. RFP ve GFP floresan filtreleri ile düz medya (hücreleri) ile görüntüler elde ve arka plan resimleri olarak kaydedebilirsiniz. Yukarıda elde edilen gerçek veriler görüntüleri çıkarmak için bu görüntüleri kullanın.
2. RFP ve GFP görüntüleri için ayrı görüntü yığını hazırlayın.
3. RFP ve GFP floresans yoğunluğu (BLT1 ve β-arrestin translokasyon) ölçmek için çeşitli bölgelerinde (yüzey vs sitozolik) Seç / tanımlamak
4. Miktarı floresan yoğunlukları zaman fonksiyonu olarak çizilir. Bu grafiği verilen molekülün translokasyonu kinetiği hakkında bilgi verecektir.

Temsilcisi Sonuçlar

A. Ölçüm Lökotrien _B 4 Yönetmen Dendritik Hücre Göç

Dendritik hücre lökotrien B ₄ (Şekil 1 ve ekli video 1) ²¹ doğru göç belirlemek için bu protokolü açıklanan yöntem kullanılmıştır. Biz, canlı hücreleri belirli bir ligand için kemotaktik hücrelerinin kapasitesini belirlemek için benzer metodoloji uygulayabilirsiniz.

Şekil 1: Fare kemik iliği 100 nM LTB ₄ yönelik dendritik hücre göç türetilmiştir.

Video 1 BMDCs doğru LTB ₄ hücre göçü Live videoyu görmek için buraya tıklayın .

B. Ölçüm GPCR (BLT1) ve Sitosolik Protein (β-arrestin) etkileşmeleri, Canlı Hücrelerde Translokasyon

Bu prosedürün tamamlanmasının ardından, bir GPCR sinyalizasyon olaylar aşağıdaki bilgileri alabilirsiniz.

1. GPCR ve sitozolik proteinler ve çekirdeğin lokalizasyonu (Şekil 2).
2. Ligand kaynaklı sitozolik protein (bu durumda β-arrestin) (Şekil 3) ile yüzey GPCR (bu durumda BLT1) etkileşimi.
3. Membran reseptör içselleştirilmesi ve β-arrestin translokasyon Kinetiği tarafından içselleştirilmesi reseptörleri (Şekil 4) (Jala'dan ve ark 2005) ¹⁸ ile birlikte izledi.
4. Bir canlı hücrelerde ligand bağımlı reseptör aktivasyonu durumu (video 2 ekli) belirlemek ve reseptör aktivasyonu (Jala'dan ve ark 2005) ¹⁸ dahil kritik motifler veya işlemlerin belirleyebilirsiniz.

Şekil 2 RBL-2H3 hücre içine BLT1-RFP (A), β-arrestin-GFP (B) pNuc-CFP (C) İfade. Renk kombine görüntü panel D'de gösterilen

Şekil 3 reseptör ligand ve β-arrestin kaynaklı translokasyon. Hücrelerde floresan yoğunlukları Hattı tarama gösterilmiştir.

Şekil 4, 1 mcM _LTB 4 eklenmesi üzerine reseptör içselleştirme ve β-arrestin translokasyon Kinetiği . Floresan yoğunlukları, hücre zarı ve sitozolik yerlerde zamanın bir fonksiyonu olarak ölçüldü.

Video 2 1 mcM LTB ₄ eklenmesi üzerine BLT1 RFP ve β-arrestin-GFP ifade hücreleri canlı görüntüleme video izlemek için buraya tıklayın

Tartışmalar

Canlı hücre görüntüleme, gerçek-zamanlı olarak meydana olarak spesifik proteinlerin fonksiyonu ve etkileşimleri göstermek için güçlü bir araçtır. Bu yazıda anlatılan yöntemleri açıkça LTB ₄ dendritik hücrelerin hızlı göç neden olduğunu göstermektedir. Bu yöntemler sadece LTB ₄ fonksiyon çeşitli hücre tipleri yönlerini genişletin, benzer yöntemlerle diğer kemokinler çeşitli uygulanan ve farklı lökosit alt popülasyonları üzerinde kemotaktik ajanlar olarak et...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells.	ATCC	CRL-2256
Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM)	Invitrogen	11995
Phenol red free RPMI or DMEM	Invitrogen	11835-030
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16000-044
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030
Penicillin-streptomycin (10000 U/mL)	Invitrogen	15140
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid	Invitrogen	25300
HEPES (1M)	Invitrogen	15630
35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish)	World Precision Instruments, Inc.	FD35-100
Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad)	Bio-Rad	16552088
Gene Pulser II electroporater	Bio-Rad
TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300	Nikon Instruments
Metamorph Software	Universal Imaging
Vertical Micro-pipette puller	Narishige International
Micro-Forge M-900	Narishige International
Hadraulic Micromanipulator MO-188NE	Narishige International
Coarse Manual Manipulator, MN-188NE	Narishige International
cDNA constructs:
cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP)	Jala et al 2005
cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study).	Jala et al 2005