Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

Özet

Için transgenlerin üretme yeteneği Caenorhabditis elegans Tüm yerli düzenleyici unsurların korunur fosmids tarafından yapılan genomik DNA kullanarak özellikle çekici. Transgenlerin üretimi için basit ve sağlam bir prosedür ile recombineering yoluyla. Açıklanan GalK Seçilebilir işaretleyici.

Özet

Transgenik hayvanların yaratılması, yaygın olarak C. kullanılmaktadır elegans araştırma, düzenleme ve faiz veya tandem afinite arıtma nesil (TAP) belirli genlerin sürümlerini kendi arıtma kolaylaştırmak için etiketli genlerin ifade desen çalışma GFP füzyon proteinleri kullanımı da dahil olmak üzere . Genelde transgenlerin GFP muhabiri gen ya da ilgi cDNA yukarı organizatörü koyarak üretilir ve bu genellikle temsil eden bir ifade kalıbı üretmektedir. Ancak, gen regülasyonu, 3 'çevrilmemiş bölge ya da alternatif rehberleri kontrol elemanları gibi kritik unsurlar, bu yaklaşım tarafından kaçırılmış olabilir. Ayrıca sadece tek bir ek çeşidi genellikle bu yolla incelenebilir. Aksine, fosmid DNA klonları tarafından yapılan solucan genomik DNA muhtemelen içerir, en gerçek ifade desen ve zamanlama yakalamak için daha fazla yetenek izin in vivo gen regülasyonu ilgili tüm unsurlar değilse . Fosmid DNA kullanarak transgenlerin üretimi kolaylaştırmak için, E. tarif coli gen herhangi bir yere GFP, TAP-etiket veya ilgi diğer dizileri eklemek için recombineering prosedür. Bu prosedür, yüksek verimlilik ile istenilen değişiklik elde sonuçlar recombineering pozitif ve negatif seçim adımları hem galK gen seçim belirteci olarak kullanır . Ayrıca, yaygın olarak kullanılan GFP homoloji kolları ile çevrili ve füzyon genleri TAP galK genini içeren plazmid GFP veya TAP füzyon proteini oluştururken,% 50 oranında oligos maliyeti azaltmak mevcuttur . Bu plazmid geniş PCR ürün arıtma için ihtiyaç engellemektedir R6K çoğaltma kökenli kullanın. Nihayet, biz de unc-119 işaretleyici fosmid doğrudan enjekte veya transgenik hayvanlar üretmek için solucanlar içine bombardıman olanak sağlar fosmid omurgasına entegre bir teknik göstermektedir. Bu video bu yöntemi kullanarak recombineering üzeri transgen üreten yer alan usul göstermektedir.

Protokol

Genel bakış

Transgenik C nesil kullanılan pek çok transgenlerin elegans promotor dizisinde oluşur ve belki de bir genin cDNA Dr. Andy ^Yangın 1 laboratuvar tarafından oluşturulan vektörlerin birine klonlanmış . Bu transgenlerin sık sık bir GFP muhabiri gen üreten veya istenilen bir desen cDNA ifade konusunda başarılı olurken, bu transgenlerin eksikliği alternatif rehberleri, artırıcı unsurları ve kontrolünde önemli rol oynarlar 3 'çevrilmemiş bölge (UTR) in vivo ² gen ekspresyonu. Örneğin, daf-12 ve fah-1 genler hem de sadece ^3,4,5 yapıları organizatörü cevapsız proksimal organizatörü dışında kalan önemli artırıcı unsurları var. Ayrıca birçok transgen yapıları uygun microRNA ^6,7,8 genler tarafından düzenlenmesi engelleyen unc-54 3'UTR kullanın. Sonuç olarak, sonsuz genomik DNA geniş kesimleri ile transgenlerin üreten tüm yararlanıcılar, splice varyantları ve 3 'UTR kontrol elemanları yakalamak için ideal olacaktır. Son zamanlarda C. genomik DNA ~ 40 kb bölgelerde oluşur ve hemen hemen tüm genomun kapsar elegans fosmid kütüphane inşa edilmiştir. Solucan genomik DNA kullanımı belirli genlerin ^2,8,9,10,11 orijinal ifade desen ve zamanlama yakalamak için büyük bir yetenek bu fosmid DNA klonları sonuçları taşıdı .

Ancak, büyük genomik DNA bölgeleri ile çalışma gibi standart moleküler biyoloji teknikleri ¹² kullanarak büyük zorluklar gibi pratik zorluklar teşkil etmektedir. Bu sınırlamaları aşmak için, teknikleri E. homolog rekombinasyon yoluyla fosmids veya bakteriyel yapay kromozom değiştirmek için coli geliştirilmiştir ve ^12,13 recombineering denir. Recombineering C. tarafından yapılan gen herhangi bir yere GFP, tandem yakınlık arıtma (TAP) etiketi veya diğer ilgi dizileri kesintisiz ekleme sağlar elegans klon ^2,10,14 fosmid. Homolog rekombinasyon, özel olarak E. hedef site ve hedef DNA homoloji 50 baz puan (bp) bölgelere göre çevrili bir PCR ürün arasında oluşur coli suşlarının.

Biz son zamanlarda C. değişiklik için iki aşamalı bir prosedür tanımlanmıştır galK gen istenen konuma ekleme ve daha sonra istenilen ^sıra 2 ile bu genin yerini içerir recombineering elegans fosmids . GalK gen seçici besi ¹⁵ üzerinden kullanıma karşı seçilebilir sürecinde iki adım için etkili bir seçim belirteci olarak hizmet vermektedir. Fosmid değişiklik ilk aşamada, galK gen homolog rekombinasyon yoluyla istenen konuma eklenir ve doğru değiştirilmiş fosmids tarafından belirlenen ^2,15 karbon kaynağı olarak galaktoz kullanma yeteneği için olumlu seçimi. İkinci aşamada, galK gen istenilen dizisi tarafından değiştirilir ve doğru değiştirilmiş fosmids galK + bakterileri öldürür ^2,15 galaktoz toksik türev deoxygalactose kullanımı yoluyla galK gen karşı negatif seleksiyon yoluyla tespit. GalK bir avantajı yeteneği, pozitif ve negatif seçim adımlar için kullanılmak üzere tek bir gen yerine, her adımı için ayrı genler, ve sonuçları, ^yüksek verim 2,15 ile istenilen değişiklik elde diğer belirteçlerin.

Bu tekniğin uygulama C. kolaylaştırmak için elegans araştırma, mevcut kaynakları çeşitli değişiklikler yaptı. İlk olarak, GFP ve TAP etiketleri yaygın solucan transgenlerin oluşturmak için kullanılan, bu yüzden galK gen kaynağı olarak hizmet pMOD4 galK-G ve pMOD4 galK-GT plazmid içine bu etiketleri her homoloji 50 baz puan ( bp) bölgelerde inşa ^2. Bu bölgeler, biraz pahalı oligos ikinci bir seti sipariş ihtiyacı kaydeder fosmid bir değişiklik iki aşaması için kullanılacak tek bir set oligos izin verir. İkincisi, bu plazmid plazmid ana recombineering için kullanılan bakteri çoğaltmak mümkün değil gibi ana plazmid veya geniş PCR ürünü arıtma sindirerek için ihtiyaç engellemektedir R6K çoğaltma kökenli ve sadece EC100 ² gibi özel suşları çoğaltabilirsiniz ^{, 16} (Tablo 1 ve Tablo 2). Son olarak transgenik C. üretme, ortak bir yol elegans unc-119 mutasyonu ¹⁷ kurtarma yoluyla transgenik solucanlar için seçim Biyolistik bombardımanı geçer. Fosmids bombardımanı ile uyumlu hale getirmek için, biz fosmid omurga ² unc-119 işaretleyici entegre etmek için kullanılan olabilir pLoxP unc-119 plazmid geliştirdi.

I. Oligo Tasarım

Recombineering ile istenilen dizileri geni içinde herhangi bir yerinde eklenebilir. Ortak siteleri, 5 'sonu veya 3' fonksiyonel alanları, ek türevleri, ya da böyle bir bölünme olarak proteazlar tarafından post-translasyonel modifikasyonlar bağlı olarak sonuna. Plazmid bir başlatıcı kodon içerir ve 3 'stop kodon (Şekil 1) yoksun olarak laboratuarımızda tarafından oluşturulan plazmid pMOD4 GFP, herhangi bir site BAYRAK etiketli GFP eklemek için kullanılır. Buna karşılık, TAP etiketi, 5 've 3' ^arıtma 18,19 sırasında kullanılan TEV bölünme nedeniyle füzyonlar için özel versiyonları vardır .

1. Gen içinde etiketi ekleme vaziyet planı. Ekleme sitesine göz önüne alındığında alternatif rehberleri, fonksiyonel alan, alternatif dilimleme ve post-translasyonel modifikasyonlar düşünün. Farklı ekleme siteleri, tüm, tek, veya belirli bir genin bazı izoformları etiketlemek için kullanılan olabilir. Ekleme noktasını memba ve mansap 50 bp bölgeleri belirleyin.
2. Oligos Tasarım (Tablo 1). 100 nM ölçekli Ya - Entegre DNA Teknolojileri jel saflaştırılmış oligos veya Ultramer oligos prosedür için kullanılabilir.
   
   GalK recombineering gerçekleştirmek için, mevcut pMOD4 galK-G ve pMOD4 galK kaset, bağlamak istenilen modifiye edilmesi site ve bu primerler sonunda 3 'yanındaki bir alana 50 bp homoloji galK primerler tasarlamak gerekir galK-GT (Şekil 1). Ileri oligo 5'olacak ------- 50 bp homoloji ------- CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA-3 've 5'------- tamamlayıcı iplikçik üzerinde 50 baz puan (bp) homoloji gibi ters bir - ------ TCAGCACTGTCCTGCTCCT-3 '.
   
   GFP ile galK recombineering gerçekleştirmek için, modifiye edilmesi (Şekil 1) İstediğiniz siteye yanındaki bir alana 50 bp homoloji pMOD4 galK-G veya pMOD4 galK-GT primerleri tasarlamak gerekir. Füzyon proteini çerçeve içinde tutmak için emin olun. ATG istenirse iptal edilebilir. Bu primerlerin 3 'ucuna galK kaset sınırdaş GFP homoloji bölgelere bağlanırlar. Not: GFP ilk ve son kodon okuma çerçevesini göstermek için altı çizilmiştir. 5'ileri oligo olacak ------- 50 bp homoloji ------- -3 '3' ve ters bir 5'------- 50 bp homoloji GATTACAAGGACGATGACGATAAGATGAG tamamlayıcı ATG iplikçik ------- CAA AGCTTGTGGGCTTTTGTATAG-3 '
   
   GalK C vadeli TAP recombineering gerçekleştirmek için, 50 bp homoloji pMOD4 galK-GT primerleri modifiye edilmesi (Şekil 1) İstediğiniz siteye yanındaki bir alana tasarlamak gerekir. Füzyon proteini çerçeve içinde tutmak için emin olun. Bu primerlerin 3 'ucuna galK kaset sınırdaş TAP homoloji bölgelere bağlanırlar. Not: İlk ve son kodon TAP okuma çerçevesini göstermek için altı çizilmiştir. 5'ileri oligo olacak ------- 50 bp homoloji ------ ATG GAAAAGAGAAGATGGAAAAAG - -3 've ters bir 5'------- tamamlayıcı iplikçik üzerinde 50 baz puan ( bp) homoloji - ------ GGT TGACTTCCCCGC -3 '
   
   GalK N vadeli TAP recombineering gerçekleştirmek için, 50 bp homoloji pMOD4 galK-GT primerleri modifiye edilmesi (Şekil 1) İstediğiniz siteye yanındaki bir alana tasarlamak gerekir. Füzyon proteini çerçeve içinde tutmak için emin olun. Bu primerlerin 3 'ucuna galK kaset sınırdaş TAP homoloji bölgelere bağlanırlar. Not: İlk ve son kodon TAP okuma çerçevesini göstermek için altı çizilmiştir. 5'ileri oligo olacak ------- 50 bp homoloji ------ ATG GCAGGCCTTGCGC - -3 've ters bir 5'------- tamamlayıcı iplikçik üzerinde 50 baz puan ( bp) homoloji - ------ AAG TGCCCCGGAGGATGAGATTTTCT -3 '
   
   
3. Sonraki adımda yanı sıra fosmid sıralanması için PCR oligos sınırdaş bir dizi oluşturun. Bunlar, standart PCR oligos yerinin memba ve mansap ~ 100 bp bağlamak gerekir.

II. SW016 Bakteriler Fosmid transfer

C. fosmids elegans fosmid kütüphanesi EPI300 bakteri suşu (F-mcrA Δ (MRR-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ (ara, ley) 7697 Galu galK λ-rpsL nupG trfA Tona) (Epicentre Biyoteknoloji, Madison, WI verilmiştir ) fosmid ifade arıtma sırasında DNA (Tablo 2) verimi artırmak için hücre başına tek bir kopya üzerinde bir artış sağlar. Recombineering fosmid SW106 bakteri suşu (mcrA Δ (MRR-hsdRMS-mcrBC) ΔlacX74 deoR endA1 araD139 Δ (ara, ley) 7697 rpsL recA1 nupG φ80dlacZΔM15 [λc1857 (cro-bioA) <> Tet transfer gerekecektir repressör ısıya duyarlı bir λ ve arabinoz indüklenebilir CRE recombinase (Tablo 2) ¹⁵ kontrolü altında λred homolog rekombinasyon genleri taşıyan] (cro-bioA) <> araC PBAD Cre ΔgalK) (NCI-Frederick) suşu.

1. Wormb kullanarak GeneService ilgi Gen (GOI) fosmid klon (Cambridge, Birleşik Krallık) siparişBir kılavuz olarak ase. Klonlar seçerken, biz dizisi merkezi GOI olanları seçin. Komşu genlerin dışarıda olanları tercih olabilir ama bulmak zor olabilir.
2. 37 ° 12.5 mikrogram / ml kloramfenikol içeren LB GOI fosmid klon Kültür ° C
3. 1,5 mL fosmid bir gecede kültür ve Epicentre fosmid hazırlık seti (Epicentre Biyoteknoloji, Madison, WI) kullanarak mini hazırlık fosmid DNA büyütün. Biz daha önceki bir aşamada Riboshredder karışımı ekleyerek içerir talimatları açıklanan alternatif protokol izleyin.
4. Spektrofotometre ile fosmid DNA konsantrasyonu belirleyin.
5. LB suyu ile 14 ml ek kapaklı tüp içinde 32 ° C'de 12.5 mg / ml kloramfenikol SW106 5 ml gecede kültür büyüyen electrocompetent SW106 hücreleri hazırlayın
6. 2 L balonuna kloramfenikol LB 100 ml 1 ml inoküle edin. Bir OD ₆₀₀ 0.6-0.8 SW106 bakteriler büyüyebilir. Isı-şok yapmayın.
7. 5000xg az 5 dakika süreyle santrifüj Pelet, nazik vorteks pelet tekrar süspansiyon ve 50 ml buz% 10 gliserol ekleyin. Bu kez yıkama adımı yineleyin.
8. Pelet santrifüj SW106 ve aspire ama her supernatant 500 ul ~
9. Nazik vorteks pelet tekrar 100 ul sıvı azot veya kuru buz üzerinde alikot ve -80 ° C ileride kullanmak üzere saklayın dondurun.
10. ~ 0.1 cm boşluk küvetler 1350 volt bir Eppendorf 2510 Elektroporatör kullanarak fosmid DNA'nın 50 ng bakteri electroporating fosmid electrocompetent SW106 hücrelerin içine DNA dönüşümü.
11. 32 ° C'de 1 saat için 1 ml LB bakteri Kurtar
12. 32 ° C gecede kloramfenikol (12.5 mikrogram / ml) ve inkübe LB plakaları Plaka alikotları.
13. Koloni PCR ile GOI varlığını kontrol edin. 32 ° C'de, 12,5 mg / ml kloramfenikol 5 ml LB gecede kültür büyütün 0.5 mcL kültür sınırdaş oligos ile standart bir PCR reaksiyonu ekleyin ve 5 dakika önce bakterilerin PCR lyse ilk 95 ° C de inkübasyon artırmak.
14. Uzun süreli depolama için bir gliserol stok hazırlayın.

III. Recombineering galK Gen yerleştirilmesi

Fosmid değişiklik ilk aşamada, galK gen homolog rekombinasyon fosmid içine eklenir ve doğru değiştirilmiş fosmids, tek karbon kaynağı (Şekil 2A) olarak galaktoz içeren minimal medya büyüme için seçilir . SW106 bakterilerin minimal medya yavaş yavaş büyür ve 3-5 gün koloniler görmek için gereklidir.

1. % 0.2 galaktoz içeren MOPS minimal medya tabak hazırlayın. MOPS minimal medya Teknova A.Ş. (Hollister, CA) (katalog # M2106) kullanılabilir, ancak içerdiği glikoz kullanmayın.
   
   MOPS minimal ortam,% 0.2 galaktoz (1 L)
   Otoklav, 870 ml su içinde 15 gram agar
   Serin - 55 ° C ve eklemek:

   100 mL	10X MOPS minimal medya
   5 ml	0.2 mg / ml d-biotin (steril süzülmüş)
   4.5 mL	10 mg / ml 'lik L-lösin (% 1, ısıtılır, sonra soğutulur ve steril süzülmüş)
   10 ml	% 20 galaktoz (otoklava)
   1 ml	EtOH 12.5 mg / ml Kloramfenikol
   2.55 mL	% 20 NH 4 Cl
   10 ml	0,132 M dibazik potasyum fosfat

2. PCR pMOD4 galK-G veya yukarıda tasarlanmış primerler kullanılarak pMOD4 galK-GT kasetleri yükseltmek. Biz Phusion (New England Biolabs, Ipswich, MA) veya GoTaq (Promega, Madison, WI) kullandık.
3. Jel çıkan bant arındırmak. Jel veya Nanodrop spektrofotometre verimi sayısal olarak. Bu PCR ürünü 3.14 adım için hazır.
4. SW106 kloramfenikol (12.5 mg / mcL) 5 ml LB fosmid DNA içeren hücreler bir gecede kültürü inoküle edin. 32 ° C büyüyecek
5. Su banyosunda 42 sallayarak ayarlayın ° C tutucu steril 250 ml'lik şişesi ile ısınmak. Sallayarak su banyosunda kullanımı, yüksek verim elde etmek için kritik öneme sahiptir.
6. 2 L balonuna LB ve kloramfenikol 100 ml 1 ml gece kültür ekleyin. OD 0.6-0.8 büyütün. Bu genellikle 3-4 saat sürer.
7. SW106 hücrelerinin 50 ml 42 250 ml'lik şişesi ve ısı-şok transfer ° C tam olarak 20 dakika. uninduced kontrol olarak 32 ° C'de 100 rpm'de sallayarak su banyosunda kalan bakteriler bırakın.
8. Uyarılan ve uninduced bakteriler 10 dakika buz üzerinde soğutun.
9. 5 dakika ~ 5000xg iki steril santrifüj tüplerine ve pelet örnekleri aktarın.
10. Süpernatantı dökün ve nazik bir vorteks (yani ayarı 3-4) 1 ml buz% 10 gliserol pelet tekrar süspansiyon.
11. Yeniden süspanse zaman, başka bir 49 ml buz% 10 gliserol ve pelet ~ 5000 örnekleri5 dakika için xg.
12. Tekrar adım 3.9, 3.10 ve 3.11 tekrarlayın.
13. Tüpleri tersini tüm süpernatantı ve kalan sıvı içinde tekrar süspansiyon pelet (yaklaşık 500 mcL her). 100 mcL örnekleri kısım, kuru buz, dondurma, ve mağaza -80 ° C Bu ay için iyi bir hafta. (Biz genellikle burada durdurmak ve ertesi gün elektroporasyon gerçekleştirmek).
14. 1350 Volt bir Eppendorf 2510 Elektroporatör set 0.1 cm boşluk küvetler kullanılarak PCR ürünü 150 ng ile tetiklenen ve uninduced SW106 hücreleri Electroporate.
15. 1 ml, 14 ml Falcon tüp LB bakteri kurtarın. 4.5 saat boyunca 32 ° C'de inkübe edin.
16. Pelet mikrofuge'de 13.200 rpm'de 15 saniye boyunca bir bakteri. Bakteriler M9 yeniden bekletildi ve daha sonra iki defa herhangi bir zengin, orta (tarifi için aşağıya bakınız) kaldırmak yıkanır.
    • M9 orta (1 L)
    • 6g Na ₂ HPO ₄
    • 3g KH ₂ PO ₄
    • 1g NH ₄ Cl
    • 0.5g NaCl
    • OTOKLAV
17. İkinci yıkamadan sonra, süpernatantı kaldırılır ve pelet MOPS minimal ortama M9 (100 mcL, 1:10 seyreltme 100 mcL ve 100 mcL 1:100) seri dilüsyonları kaplama önce 1 ml M9 yeniden süspanse.
18. 32 ° C bir kuluçka 3-5 gün inkübe edin. Not: gerçek pozitif yavaş büyüdükçe sabırlı olun.
19. MacConkey agar göstergesi plakalar üzerine Streak birkaç kolonileri (BD # 281.810),% 1 galaktoz ve kloramfenikol 12.5 mikrogram / mL ile desteklenmiştir. Son adımdan sonra görünen koloniler galK + olmalıdır, ancak herhangi bir galK kurtulmak için - kirleticiler, ikinci adıma geçmeden önce tek, parlak pembe koloniler elde etmek için önemlidir. GalK - kolonileri renksiz / beyaz olacak ve galK + bakteri, parlak pembe / kırmızı bir gecelik inkübasyondan sonra 32 fermente galaktoz kaynaklanan bir pH değişikliği nedeniyle olacak ° C.
20. Pick tek bir koloni ve 32 büyüme için 5 ml LB + kloramfenikol gecede kültürü aşılamak ° C.
21. Sınırdaş oligos kullanarak PCR ile uygun bir yere yerleştirilmesi galK gen onaylayın. Standart bir PCR reaksiyonu kültürünün 0.5 mcL ekleyin ve 5 dakika bakteri lyse ilk 95 ° C de inkübasyon artırmak. PCR ürünü galK genin varlığı nedeniyle boyutu upshifted olmalıdır.
22. Gliserol stok depolama için hazırlayın.

IV. Recombineering Etiket sıralarıyla galK Değiştirilmesi

Bu aşamada galK gen istediğiniz etiketi dizileri ve doğru değiştirilmiş fosmids galK gen karşı toksik galaktoz analog deoxygalactose (KÖPEK) (Şekil 2B) tarafından seçimi için seçilen tarafından değiştirilir.

1. % 0.2 deoxygalactose (DOG) ve% 0.2 gliserol içeren MOPS minimal medya tabak hazırlayın. MOPS minimal medya Teknova A.Ş. (Hollister, CA) (katalog # M2106) kullanılabilir, ancak içerdiği glikoz kullanmayın.
   
   MOPS minimal ortam,% 0.2 KÖPEK ve gliserol (1 L)
   Otoklav, 860 ml su içinde 15 gram agar
   Serin - 55 ° C ve eklemek:

   100 mL	10X MOPS minimal medya
   5 ml	0.2 mg / ml d-biotin (steril süzülmüş)
   4.5 mL	10 mg / ml 'lik L-lösin (% 1, ısıtılır, sonra soğutulur ve steril süzülmüş)
   10 ml	% 20 deoxygalactose (steril süzülmüş)
   10 ml	% 20 gliserol (otoklavlanmış)
   1 ml	EtOH 12.5 mg / ml Kloramfenikol
   2.55 mL	% 20 NH 4 Cl
   10 ml	0,132 M dibazik potasyum fosfat

2. PCR, ilk turda kullanılan ya da kısa GFP veya TAP özel oligos (adım 1.2 'de iç dizileri kullanarak aynı oligos kullanarak pMOD4 GFP, pBS1761 (N vadeli TAP), ya da pBS1479 (C vadeli TAP) etiket parçaları yükseltmek .) Birden fazla yapıları yapıyorsanız, aynı PCR ürününün tüm yapıları için kullanılabildiği gibi kısa oligos kullanmak için özellikle yararlıdır.
3. Jel PCR ürünü arındırmak ve jel veya spektrofotometri ile konsantrasyonu ölçmek.
4. Indüklenen ve yukarıdaki aşağıdaki adımları 3,4-3,13 takılı galK gen ile fosmid taşıyan yetkili SW106 uninduced oluşturun.
5. 1350 voltta bir Eppendorf 2510 Elektroporatör set 0.1 cm boşluk küvetler kullanılarak PCR ürün ~ 100 ng ile tetiklenen ve uninduced SW106 hücreleri Electroporate.
6. Kurtar, 4,5 saat için 32 ° C çalkalayıcı 14 ml ek kapaklı tüp ve inkübe 1 ml LB.
7. Yıkayın ve 3.16 ve 3.17 adımları olarak bakteri sulandırmak. Plaka 0.2% 2-deoksi-galaktoz (DOG) ve% 0.2 gliserol içeren MOPS minimal medya plakaları bakteri.
8. Üç gün boyunca 32 ° C'de inkübe edin.
9. Dört koloniler 5 ml yapmak için kullanılır12.5 mikrogram / ml kloramfenikol LB geceleme kültürler. Kaset takılı olduğunu doğrulamak için yukarıdaki gibi koloni PCR için kullanılır. Biz, hem kısa GFP / doğru yerleştirin ve sağ sitesinde göstermek için belirli oligos ve yan oligos TAP. GFP ~ 800 bp ve galK 1.4 kb ise TAP ~ 550 bp.
10. Gliserol stok hazırlayın.

CRE-loxP Rekombinasyon V. unc-119 Gen ilavesi

Biyolistik bombardıman kullanımı yoluyla değiştirilmiş fosmids transgenik hayvanlar üretmek ortak bir araç. Bu teknik, C. içine fosmid DNA tanıtmak için DNA kaplı altın parçacıkları kullanır. elegans. Transgenik hayvanlar genellikle bir unc-119 transgen unc-119 mutant kurtarma yoluyla tanımlanır. Bu adımda, unc-119 gen pLoxP CRE-loxP rekombinasyon cis fosmid omurgasına eklenir unc-119 plazmid (Şekil 2C).

1. Adım 4.9 adımları 2,5-2,9 kullanarak değiştirilmiş fosmid taşıyan yetkili SW106 bakteri hazırlayın. Yapmayın neden 42 ° C
2. 50 ng Electroporate. pLoxP unc 1350 volt Eppendorf 2510 Elektroporatör 0.1 cm boşluk küvetler kullanarak bir mini-hazırlık-119.
3. 32 ° C'de 1 saat süreyle% 0.1 arabinoz içeren LB bakteri Kurtar
4. 50μg/mL ampisilin ve 12.5 mcg / ml kloramfenikol içeren LB plakaları Plaka alikotları. 32 ° C'de bir gece inkübe edin. fosmid unc-119 pLoxP entegrasyonu için seçer.
5. LB 50μg/mL ampisilin ve 12.5 mcg / ml kloramfenikol içeren bir gecede kültürü büyütün. Unc-119 F (5'-CAAATCCGTGACCTCGACAC-3 ') ve unc-119 R (5'-CACAGTTGTTTCTCGAATTTGG-3') oligos (Tablo 1) ile unc-119 genin varlığını doğrulamak PCR 0.5 mcL kullanın.
6. Son fosmid bir gliserol stok olun.

VI. Büyük Ölçekli Fosmid Hazırlık

Bombardıman için gerekli fosmid DNA büyük miktarlarda elde kolaylaştırmak için, bu adımda fosmid EPI300 bakterilere transfer edilir. Bu gerginlik DNA hazırlanması sırasında verimi artırmak için fosmid kopya sayısını artırmak için yeteneği vardır.

1. Grow gecede kültür bakterilerin 5 ml ampisilin ve kloramfenikol içeren LB adım 5.5 'ten 32 ° C'de 1.5 mL kültür fosmid izole etmek için Epicentre fosmid hazırlık kiti kullanın.
2. Electroporate ~ 1350 volt Eppendorf 2510 Elektroporatör set 0.1 cm boşluk küvetler kullanarak EPI300 bakteri içine 50 ng. EPI300 bakteriler Epicentre Biyoteknoloji (Madison, WI) satın alınabilir.
3. 1 saat süreyle 37 ° LB bakteri Kurtar ° C 50 mcg / mL ve 12.5 mcg / ml kloramfenikol içeren LB agar Plaka alikotları.
4. Dahil yönergeleri kullanarak modifiye fosmid içeren EPI300 bakterilerin üremesine neden olur. 50 ml indüklenen kültür saflaştırılmış fosmid DNA> 10 mg verecektir. Epicentre fosmid hazırlık kiti ile fosmid arındırın.

VII. Bombardıman

1. 10 mikrogram kullanın. bombalamaya fosmid DNA DP38 solucan cins olarak tanımlanmıştır (D. Hochbaum, A. Ferguson, ve A. Fisher, vallahi, in press).

VIII. Temsilcisi Sonuçlar

Negatif seçim adımda güçlü ve>% 90 başarı oranları recombineering yoluyla fosmids değişiklik rutin ² gözlenmektedir. Bu protokol aynı zamanda, yaklaşık 2 hafta tamamlamak için oldukça hızlı transgenlerin hazırlık yapar sürer. Protokol ^ayrıca, 20 başarı ile diğer laboratuvarlar tarafından denenmiştir .

Oligo	Dizi
C vadeli TAP F	ATGGAAAAGAGAAGATGGAAAAAG
C vadeli TAP R	GGTTGACTTCCCCGC
BAYRAK-GFP F	ATGGATTACAAGGACGATGACGATAAGATGAG
BAYRAK-GFP R	CAAAGCTTGTGGGCTTTTGTATAG
N vadeli TAP F	ATGGCAGGCCTTGCGC
N vadeli TAP R	AAGTGCCCCGGAGGATGAGATTTTCT
galK F	CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA
galK R	TCAGCACTGTCCTGCTCCT
unc-119 F	CAAATCCGTGACCTCGACAC
unc-119 R	CACAGTTGTTTCTCGAATTTGG

PCR için kullanılan Tablo 1. Oligonükleotidler.

Plazmidler	Kaynak	Available at
Fosmid klonu	Geneservice Ltd.	Geneservice
pGalK	15	NCI-Frederick
pMOD4-RT-G	2	Addgene
pMOD4-galK G
pMOD4-galK-GT
pLoxP-unc-119
pMOD4-GFP
Bakteriler
SW106	15	NCI-Frederick
EPI300	Epicentre Biyoteknoloji	Epicentre
EC100D pir-116

Tablo 2 Strain ve vektör kullanılabilirliği.

Şekil 1.
PMOD4-galK-G ve pMOD4-galK-GT, pMOD4 GFP, pLoxP-unc-119 diyagramı
PMOD _4-galK-GT galK oluşur pMOD4 galk-G plazmid 5 've 3' BAYRAK sona erer (Brown)-GFP (yeşil) aynı 50 nükleotid bölgelere göre çevrili galK kaset (siyah) oluşur 5 've 3' uçları, N-terminal ve C-terminal TAP (sırasıyla mavi ve turuncu) aynı BAYRAK-GFP homoloji bölgeleri ve 50 nükleotid bölgelerde her iki tarafından çevrili kaset. pMOD4-BAYRAK-GFP 5 'BAYRAK etiketi ve pLoxP unc-119 loxP sitesi içeren bir plazmid unc-119 genomik sekans (mor) oluşan tam GFP kaset oluşur. Tüm plazmid SW106 olarak çoğaltmak mümkün R6K tabanlı pMOD4 (kırmızı) omurga kullanmaktadır.

Şekil 2.
GalK recombineering sürecinin Genel Bakış
Şekil 2A-2C galK kaset kullanarak recombineering ilgili adımları ve saatini gösteren ayrı rakamlar. Bu aynı rakamları Şekil 2d birleşti, ancak netlik ve okuma kolaylığı için ayrı ayrı verilmektedir. Ilgi fosmid (BAYRAK-GFP veya TAP tarafından bu kaset değişimi takip BAYRAK-GFP veya TAP (Şekil 2A) homoloji 50 bp bölgeleri ile çevrili galK kaset ekleme içeren iki aşamalı bir prosedür güncellenmiştir. Şekil 2B). Daha sonra transgenik hayvanlar elde kullanmak için unc-119 işaretleyici fosmid omurga (Şekil 2C) LoxP siteye eklenir .
Şekil 2D galK recombineering prosedürü birleştirilmiş bir figür gösterir.
Şekil 2A-2C birleştirilmesi her adım için gerekli olan yukarıda da dahil olmak üzere zaman içinde açıklandığı gibi galK recombineering prosedürü Anahat.

Şekil 2a. Galk recombineering galk ekleme.

Şekil 2b. Galk recombineering TAG (GFP / TAP) ekleme.

Şekil 2c. Unc-119 ek.

Şekil 2d galk recombineering birleştirilmiş bakış.

Tartışmalar

Fosmids gelen transgenlerin nesil ana organizatörü elemanları, splice varyantları ve 3 'UTR düzenleyici elemanlar tüm istinat yararına sunmaktadır. Bu yerli ifade desen, ya da diğer yaklaşımlar ^başarısız 5 işlevsel bir transgen inşaat daha yansıtıcı bir transgen inşaat yol açabilir . Ortaya çıkan transgenlerin GFP veya TAP etiketi epitopu etiketleri de dahil olmak üzere çeşitli taşıyabilir.

Transgenlerin inşaatı tüm SW106 bakteriyel leke ^15<...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
FosmidMAX kit	Epicentre Biotechnologies	FMAX046
GoTaq	Promega Corp.	M7122
MOPS Media	TEKnova, Inc.	M2120
0.132 M Potassium phosphate solution	TEKnova, Inc.	M2102
D-galactose	Sigma-Aldrich	G0750
2-deoxygalactose	Sigma-Aldrich	D4407
Biotin	Sigma-Aldrich	B4639
Leucine	Sigma-Aldrich	L8000
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434
Phusion DNA polymerase	New England Biolabs	F-530S
MacConkey agar base	BD Biosciences	281810
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3131
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S5136
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025
Bacto Agar	BD Biosciences	214010