Bir Tümör Mikroçevre yeniden oluşturmak için mikroakışkan Cihazı<em&gt; In vitro</em

Özet

Biz heterojen tümör mikroçevrelerde yeniden bir mikroakışkan cihazın imalat ve operasyon için prosedür sunmak In vitro. Tümör dokusu içinde apoptosis değişkenliği değerlendirildi floresan lekeleri ve tümör dokusu içine kemoterapötik ilaç doksorubisin etkin difüzyon katsayısı kullanılarak ölçüldü.

Özet

Biz in vitro heterojen üç boyutlu tümör dokulara teslimat ve ilaçların sistemik klirensi taklit eden bir mikroakışkan cihaz geliştirdik. Damar tarafından teslim Besinler canlı, sakin ve nekrotik hücre tipleri oluşan heterojen mikroçevrelerde sebebiyet veren tümörler tüm bölümlerine ulaşmak için başarısız. Birçok kanser ilaçlarının etkili hücreleri nedeniyle bu heterojenlik her türlü nüfuz ve tedavisinde başarısız. Kanser hücrelerinin tek katmanlarını zor in vitro model bir uygun olan kanser ilaçlarının test etmek için yapma, bu heterojen taklit ederler. Bizim mikroakışkan cihazları yumuşak litografi kullanarak PDMS üzerinden hazırlandı. Asılı damla yöntemi ile oluşturulan Multisellüler tümör sferoidler, eklenen ve kısıtlı cihaz üzerinde dikdörtgen odasına ve bir tarafta sürekli orta perfüzyon ile muhafaza edildi. Cihazda odaları dikdörtgen doku içinde doğrusal basamaklara yarattı. Floresan lekeleri inci ölçmek için kullanılmıştırdokusu içinde apoptozis e değişkenliği. Cihazda Tümörler floresan kemoterapötik ilaç doksorubisin, time-lapse mikroskopi doku içine onun difüzyon izlemek için kullanılan ve etkin difüzyon katsayısı tahmin edilmiştir ile tedavi edildi. Asılı damla yöntemi çeşitli kanser hücre hatları düzgün sferoidlerin hızlı oluşumunu sağladı. Cihaz en fazla 3 gün için sferoidlerin büyüme sağladı. Orta akan yakınlığı Hücreleri minimal apoptotik vardı ve bu çok kanaldan böylece doğru kan damarları komşu tümörlerde bölgelerde taklit, daha apoptotik vardı. Doksorubisin difüzyon katsayısının tahmini değeri insan meme kanseri daha önceden bildirilen değeri ile anlaştılar. Solid tümörler ilaç penetrasyonu ve kalıcılık onların etkinliğini etkilediği için, bu cihazın uyuşturucu davranışını anlamak ve yeni kanser tedavi geliştirilmesinde önemli bir araç olduğuna inanıyoruz.

Protokol

1. Cihaz İmalatı

Elastomerik malzemeler içinde mikroakış özellikleri çoğaltma Duffy ve diğerleri tarafından tarif edilen metoda dayanır. ¹

1. Karışım elastomer (polidimetilsiloksan, PDMS) ile 9:1 ağırlık oranında silikon elastomer Kit (Dow Corning, Midland, MI) sertleştirme maddesi ve 4 mm kalınlığında bir katman oluşturmak için ana üzerine dökün. Degas, 5 saat boyunca 60 ° C 'de hava kabarcıklarını çıkarmak ve karışım tedavi etmek. Peel Elastomer üzerindeki akış özellikleri bir damga elde etmek için kalıp PDMS tedavi.
2. 1.5 mm biyopsi yumruk (Miltex, York, PA) kullanılarak giriş ve çıkışları için Punch delik bir matkap basın üzerine monte. Herhangi bir enkaz dışarı çekin.
3. Damga özellikleri yan ve bir oksijen plazma yakıcısı 8 dakika oksijen plazma temiz bir cam slayt koşuluyla. Bunların arasında bir bağ oluşturmak üzere hemen temas içinde muameleye tabi olan yüzeylerde getirin. En az 5 saat süreyle sıcak bir slayt üzerine 60 ° C'de montaj koruyuns bağı güçlendirmek için.
4. Dikenli dişi luer lock konnektör (Qosina, Edgewood, NY) bağlı erkek luer kilit bir arabirim konnektörleri kullanarak giriş ve çıkışları için 0.032 "ID PTFE (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) bağlayın.
5. Vafleri ve bir Y-konnektör (; Şekil 1 Upchurch Bilimsel, Oak Harbor, WA) kullanarak akış montaj ayarlayın. Mikroskop cihazı monte edin. 20G 1.5 "iğne (Bioscience BD, Rockville, MD) kullanılarak tüp için şırınga takın.

2. Üniforma sferoidlerin Oluşumu

Sferoidler asılı damla yöntemi ^2,3 oluşturulmuştur.

1. Steril bir hücre kültürü kaputu altında hücreleri Trypsinize.
2. 5 dakika boyunca 2000 rpm'de santrifüje hücreler tripsinize ve 6 ml taze ortam içinde tekrar süspansiyon haline getirin. Istenen bir nihai konsantrasyon (Tablo 1) stok çözeltisi ile seyreltilir.
3. 48 kuyu plaka kapağını çıkarın ve ste baş aşağı yerleştirinkaput rilized. Her iyi karşılık Genelgesi bölgelerde kapağında görülür. Nemi korumak için sterilize 1 mL su ile plakanın her doldurun. Bir mikropipet kullanılarak her bir dairesel bölge içinde seyreltilmiş hücre solüsyonu 20 ul damlacık koyun. Dikkatli bir şekilde kapağı ters çevirin ve damla kuyuların kenarlarına dokunmayın sağlanması, plaka üzerine yerleştirin.
4. Belirli bir gün sayısı (Tablo 1) için 37 ° C'da plaka inkübe edin. Bir sfero Her asılı damla oluşturacaktır.

3. Cihaz içine sferoidlerin Giriş

Bu bölüm için 1 ve Tablo 2 Şekil bakın.

1. Akış giriş aracılığıyla uygulamaya% 70 etanol ile yıkama yoluyla sterilize cihaz. PBS hücre besiyerinin tamponlu HEPES izledi sahip sonra, yıkayın. Tüp bağlı orta şırınga S _F bırakın.
2. Şırınga S _P içine 2-3 sferoidler çizin, hava kabarcıklarını çıkarmak için şırınga dokunun veCihazın ambalaj giriş bağlanırlar.
3. Açık giriş vanası V _Pin ve yakın V _Fin. Aç çıkış valfi V _Pout ve yakın V _Fçıkış. Aşağı doğru iğne ile dikey paketleme şırıngayı tutun; sferoidlerin iğne luer lock konnektör içine şırınga altına yerleşmek gibi izleyebilirsiniz. Ambalaj şırınga ve izlemek sferoidler üzerindeki pimi itin cihazın içine boru ve akış girin. Ancak ambalaj çıkış valfı açık olduğundan, bir küremsi cihazın odasına girer ve arka (Şekil 2) ileti korunabilir.
4. Kapat giriş vanası V _Pin ve çıkış vanası V _Pout. Bir şırınga pompası üzerinde şırınga S _F monte edin. Açık vana V _Fin ve vana V _Fçıkış. 3 ul / dk akış cihaz içine ortamı.

4. Apoptoz algılama Agent Giriş (CaspGLOW)

Sferoidler sahip odaları ambalaj sonra, u için dengeleme izintespit apoptozis veya terapötik ajanlar tanıtmadan önce, besin gradyanlar ve mikroçevrelerde kurmak için 24 saat s. Odasındaki doku üst ve alt delinmez duvarları ile temas halinde oldukları için, doku kalınlığı boyunca hiçbir besin eğimleri (0,15) bulunmaktadır. 24 saatlik inkübasyon sonrasında doku kalınlığı boyunca hücre tabakaları bu nedenle eşdeğerdir ve sadece heterojen uzağa akış kanalından bir yönde.

1. V _Fin kapatın, şırınga pompası durdurmak, pompa şırınga S _F kaldırmak ve 0.25 ul / CaspGLOW Kırmızı Aktif Kaspaz-3 işaretleyici (Kırmızı-DEVD-FMK ml içeren orta olan bir şırınga ile değiştirin; Biovision, Mountain View, CA).
2. El ile büyük orta yerinden sağlamak için aygıt ile bu çözeltinin 0.7 ml yıkayın. , Pompa üzerinde şırınga monte akışını yeniden başlatın ve açık V _Fin. 5-8 saatlik bir süre içinde, apoptoz t içine ajan diffüze tespitO doku ve apoptotik bölgelerinde parlak fluoresces. Bu konsantrasyonda Apoptoz tespit ajan cihaza sonraki tüm akış çözümleri korunur.

Not:

1. Doku heterojenlik Bölüm 6'da tarif edildiği gibi flöresan doğrusal yoğunluk profilleri elde ile teyit edilebilir. Profiller doku hücre canlılığı açısından heterojen olduğunu doğrulayarak, apoptoz mekansal degradeleri göstermelidir.
2. CaspGLOW Green Aktif Kaspaz-3 işaretleyici (fluorescein-DEVD-FMK; Biovision) aynı zamanda apoptoz tespit etmek için de kullanılabilir. Bu işaretleyici yerine kırmızı fluorofor rodamin arasında yeşil fluorofor floresein içerir.

5. Terapötik Ajan Tanıtımı

1. Ajan tespit apoptoz içeren; 10 uM doksorubisin hidroklorür (Sigma-Aldrich, St Louis, MO Dox) tanıtmak için adımlar 4,1-4,2 bulunan yordamı izleyin.
2. Therape akışı devamzaman sabit bir süre için utic ajan çözeltisi. Vana V _Fin kapatın ve şırınga pompası kapatın. Ajan tespit apoptoz içeren taze orta şırınga ile tedavi şırınga değiştirin. Sürekli mikroskop altında doku izlerken 24 -36 saat süreyle taze orta akışı sağlayın.

6. İlaç Diffüzivite Katsayıları Time-lapse Mikroskopi ve Kestirim

Temiz floresans verileri elde etmek için, dokuların alt katmanları üzerinde mikroskop odaklanarak tüm görüntüleri elde. Dikey yönde hiçbir besin eğimleri (bakınız Bölüm 4) olduğundan, hücrelerin alt tabakaları üzerindeki tüm diğer tabakaların iyi temsilcileridir.

1. Tüm satın alma süreci IPLab bir özelleştirilmiş komut (Bioscience BD, Rockville, MD) kullanılarak otomasyona geçilmiştir. 10x büyütmede dolu spheroid her 30 dakikada bir (Şekil 3A) iletilen ışık ve floresans görüntüler elde edin. Acquirönceki Dox tanıtılması için arka plan floresan e bir görüntü. Odanın büyüklüğü (1000 mikron x 300 mikron) için yerleştirmek için, iki komşu görüntüleri ve birlikte çini onları ⁴ kazanır.
2. Ilacın difüzyon katsayılarının matematiksel tahmini için, ilk adım ImageJ kullanarak Dox floresans ortalama lineer yoğunluğu profilleri üretmektir. Odasında doku kapsayan ilgi dikdörtgen bir bölge (ROI) seçin. Akış kanalından mesafenin bir fonksiyonu olarak ortalama yoğunlukları bir profil oluşturmak için Plot profili komutunu kullanın. 3 adede kadar farklı zaman noktaları için tekrarlayın.
3. Dokudan otofloresans ölçmek için Dox tanıtmadan önce bir arka plan floresan görüntüsü elde edin. Elde edilen yoğunluğu profillerden ortalama arka plan floresan yoğunluğu çıkarma ve elde etmek için gelen maksimum yoğunluğu her profili normale (X, t) (Şekil 3B).
4. Bir sonraki adım, tümör dokusu içinde Dox etkili bir difüzyon katsayısı D değerlendirmektir. Dox difüzyon aşağıdaki denklem ⁵ ile temsil edilebilir
   
   TÜMHATAİŞLEV tamamlayıcı hata fonksiyonu olduğu, x kanaldan doku içine mesafe ve t Dox tanıtılması (Şekil. 3'e bakın) sonra zaman. Ele alındığında her zaman noktasında aşağıdaki yinelemeli şeması kullanın:
   • D için bir ne olacağını tahmin
   • Her yerde, x eşitliğin sağ tarafına hesaplayın
   • İki taraf arasındaki karesi hataların toplamı (rezidü) hesaplayın
   • Kalıntı en aza indirmek için D değiştirme
5. Ortalama dokuda Dox arasında ortalama etkin difüzyon katsayısı tahmin etmek her zaman noktasında alınan D optimum değerleri.

7. Temsilcisi Sonuçlar:

mikroakışkan cihazlar 1mm verilmedi x 0.3mm x 0.15mm optik üç boyutlu tümör dokusunun büyümesi için erişilebilir kültürü odaları. Çok hücreli tümör sferoidler bu odaların içine uçakla edildi ve arka iki filtre mesajlarını tarafından muhafaza edildi. Asılı damla yönteminde, tutarlı bir boyut ve çeşitli hücre hatlarından şekilli parçacıkları arasında hızlı oluşumunu sağlamıştır. 3 güne kadar sferoidler için başarılı bir aygıt üzerinde yetiştirilmiştir. Odacıklarda Büyüme sferoidlerin içinde mikroçevrelerde bir tekrarlanabilir modifikasyonu ile ilişkili bulunmuştur. Apoptosis, akış kanalı ve doku içine daha yüksek bir derin bir yakınlık içinde hücrelerinde daha az olmuştur. Cihaz, tümör dokusunda doksorubisin difüzyon katsayısı tahmin etmek için kullanıldı. 8.75 x 10 ^-7 cm ² s ^-1 elde edilen değerin 9.1 değeri ile aynı fikirde x 10 ^-7 cm ² s ^-1 insan meme kanseri daha önce ^6. Min.

Hücre Hattı	Gerekli Hücre Konsantrasyon	İnkübasyon Süresi
LS174T	300 hücre / ml '	2-3 gün
T47D	750 hücre / ml '	3-4 gün
MDA-MB-231	150 hücre / mcL	5-6 gün

Asılı Damla sferoidler için Tablo 1. Parametreler

Kısım	Tanım
S F	Akış Şırınga
S P	Şırınga Ambalaj
V Fin	Akış Giriş Valfi
V Pin	Giriş Valfi Ambalaj
V Fçıkış	Akış Outlet Vana
V Pout	Outlet Vana Paketleme

Akışı Kurulumu Tablo 2. Enjektörler ve Vanalar

Şekil 1 akışını kurulum V _Fin ve V _Fçıkış şematik:. Akış giriş ve çıkış valfleri, V _Pin ve V _Pout: Ambalaj giriş ve çıkış valfleri, S _F ve S _P: Akış ve ambalaj şırınga. Bir sfero odasına uçakla olduğunda ambalaj şırınga ve giriş ve çıkış vanalarının ambalaj kullanılmaktadır. Akış şırınga ve akım giriş ve çıkış valfleri daha sonra orta akış için kullanılır.

Şekil 2. Cihaz üzerinde bir çember içinde sıkışıp kalmış bir spheroid şematik. A spheroid cihazda odasına akar ve iki filtre pos tarafından engellendiOdanın arka ts.

Şekil 3,. Cihaz üzerinde tümör dokusunda Doksorubisin difüzyon. A. doksorubisin yerini ve konsantrasyon (kırmızı) gösteren, doku iletilen ışık ve kırmızı floresan görüntü birleştirilmiştir. Ölçek çubuğu 250 mikron temsil eder. Doksorubisin floresansı B. Normalize lineer yoğunluk profili.

Tartışmalar

Tümörlerde damar seyrek ve kötü ^7,8 geliştirdi. Damar ⁹ olsa sağlanan besinler ve ilaçlar için ulaşılmaz olan kan damarlarından (> 100 mikron) uzakta bulunan bölgeler vardır. Sonuçtaki heterojen mikroçevrede birçok kemoterapötik ¹⁰ sınırlı etkinliğe katkıda bulunmaktadır. Burada geliştirilen mikroakışkan cihaz in vitro, sakin ve apoptotik ya da nekrotik hücre genişlemesi ile karakterize heterojen bir tümör mikro yaratır. Kanalın yakınlık hücreler, uy...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Silikon elastomer kiti	Ellsworth Yapıştırıcılar	184 Sil Elast Takımı
Miltex biyopsi yumruk	MedexSupply	MTX-33-31AA	1.5 mm
PTFE tüp	Cole Parmer	EW-06417-31	0.032 "ID
Erkek luer lock konnektör	Qosina	65111
Dikenli dişi luer lock konnektör	Qosina	11556
Kapatma vanası	IDEX Sağlık ve Bilim	P-721
Y-konnektörü	IDEX Sağlık ve Bilim	P-513
20G 1.5 "iğneleri	BD BiosciencE	305176
Tripsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
HEPES	Sigma	H-4034
CaspGLOW Flöresein	Biovision	K183-25
CaspGLOW Kırmızı	Biovision	K193-25
Doksorubisin hidroklorür	Sigma	44583
LS174T	ATCC	CCL-188	İnsan Kolon Karsinomu hücre hattı
T47D	ATCC	HTB-133	İnsan Duktal Karsinoma hücre hattı
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26	İnsan Meme Adenokarsinom hücre hattı