Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

Özet

Meyve sineği Drosophila melanogaster, erken gelişimi iyi görüntüleme yaklaşımlar için uygundur hücre şekil değişiklikleri bir dizi ile karakterizedir. Bu makale, Drosophila embriyolar canlı konfokal görüntüleme için gerekli olan temel araçları ve yöntemleri tanımlamak ve cellularization denilen bir hücreye şeklini değiştirmek üzerinde durulacak.

Özet

Gelişmekte olan Drosophila melanogaster embriyo konfokal görüntüleme yaşamak için son derece müsait olan hücre şekil değişiklikleri bir dizi uğrar. Hücre sinek şekil değişiklikleri, yüksek organizmalarda benzer olup, doku morfolojilerinden sürücü. Yani, birçok durumda, yaptıkları çalışmada insan hastalığı (Tablo 1) ^1-5 anlamak için doğrudan etkisi vardır. Hücre alt ölçekte, bu hücre şekil değişiklikleri, gen ekspresyonu, sinyal iletimi, hücre polarite, iskelet remodeling ve membran ticareti değişen faaliyetlerinin ürünüdür. Böylece, Drosophila embriyo doku morfolojilerinden ile ilgili olarak hücre şekil değişiklikleri değerlendirmek bağlamında sadece sağlar, ama aynı zamanda şekil hücreleri, alt-hücresel faaliyetler çalışma tamamen fizyolojik bir ortam sunmaktadır.

Burada açıklanan protokol görüntü cellularization denilen özel bir hücre şeklini değiştirmek için tasarlanmıştır. Cellularization, dramatik plazma membran büyüme bir süreç olduğunu ve sonuçta hücresel blastodermin sinsityal embriyo dönüştürür. Interfaz mitotik döngüsü 14 olduğunu, plazma zarı aynı anda birincil epitel hücrelerinin bir sayfa oluşturmak için her ~ 6000 cortically demirlemiş çekirdeklerinin etrafında invaginates. Sayaç önceki önerileri, cellularization Miyozin-2 kontraktilite ⁶ tarafından yönlendirilen değil, ancak bunun yerine büyük ölçüde iç ^mağazaları 7 zarının ekzositoz tarafından körüklenen . Böylece, cellularization sitokinez veya enine-borucuk (T-tübül) kas morfolojilerinden olarak plazma zarı invajinasyon veya genişleme gerektiren hücre şekil değişiklikleri sırasında membran kaçakçılığı eğitimi için mükemmel bir sistem.

Bu protokol sinek embriyo diğer hücre şekil değişiklikleri görüntüleme kolayca uygulanır ve sadece embriyo toplama aşamasında, değiştirme veya belirli bir oryantasyon (Tablo embriyo monte etmek için "embriyo tutkal" olarak hafif uyarlamalar gerektirir olduğunu unutmayın 1) ^8-19. Tüm durumlarda, iş akışı temelde aynıdır (Şekil 1). Klonlama ve Drosophila transgenesis için standart yöntemler, Yeşil Floresan Protein (GFP) veya türevleri erimiş bir ilgi protein ifade istikrarlı sinek stokları hazırlamak için kullanılan ve bu sinekler, embriyo yenilenebilir bir kaynak sağlamak . Alternatif olarak, floresan proteinleri / problar doğrudan sinek embriyolara ^9-10 basit mikro-enjeksiyon teknikleri ile tanıtıldı. Sonra, gelişimsel bir olay ve görüntülü olarak hücre şekil değişikliği göre, embriyolar toplanan ve diseksiyon mikroskobu morfolojisi tarafından sahnelenen, ve son olarak konumlandırılmış ve zaman atlamalı bir konfokal mikroskop görüntüleme için monte edilmiş.

Protokol

1. Embriyo Koleksiyon Bardaklar birleştirin

1. Mümkün olduğunca pürüzsüz kenar, ustura ile 100 ml Üç mısır beher alt kesti. Bu kesinlikle gerekli olmasa da, bardak, aynı zamanda üst kapalı üç köşe Döşeme halinde ele kolaydır.
2. Tel örgü (6 cm x 6 cm) bir kare kesin. Önceden ısıtılmış sıcak levha, iç davlumbaz, katman, ağır alüminyum folyo bir parça üstüne tel örgü kare. Kesme alt kenarı fincan sıcak örgü üzerine sıkıca bastırın. Birkaç saniye bekleyin ve şimdi bağlı mesh ile kupayı kaldırmayı. Folyo da sopalarla ise, sadece o kabuğu.
3. Gecede bardağı soğutun. Ince taneli zımpara kağıdı ile herhangi bir keskin kenarları aşırı makas örgü, kum ve çıkarın.

2. Elma Suyu Agar Tabaklar olun

1. 6L şişesi, 100 g BD Bacto Agar ve 3L distile su birleştirir. 30 dakika yavaş egzoz ayarı agar Otoklav.
2. Bir heyecan çubuğu ile 2L şişesi, 100 g sakaroz, 1L elma suyu, ve 6 g p-hidroksibenzoik asit birleştirir. Sıcak bir plaka üzerine karıştırarak kaynama çözüm ısıtın. En fazla 2 dakika boyunca kaynatın. Elma suyu karışımı serin ve daha sonra heyecan çubuğu ile agar eklemek için izin ver. Tamamen karıştırın.
3. 60x15 mm petri kaplarına dökülmeden önce 60 ° C su banyosunda soğutmak için kombine bir çözüm izin verin. Alternatif olarak, bir peristaltik pompa agar dağıtmak için kullanılabilir. Plakaları, en az 4 saat süreyle oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. 4 ıslak kağıt havlu ve mağaza bir katman ° C ile Rubbermaid kaplarda Stack

Notlar:

• Sonbahar ya da kış, ek bir 100 ml su agar eklemek için gerekli olabilir.
• Petri kutularının marka önemlidir! Sadece BD Falcon yemekleri mısır Üç bardak uygun. Özel sipariş bilgileri aşağıda Malzeme tablo bulunabilir.

3. Embriyo Koleksiyon Bardaklar GFP Sinekler

1. Şişe kurarak toplama ihtiyaçlarına göre GFP stokları genişletin görüntüleme için yaklaşık iki hafta önce uçar. Bir şişe sinek genellikle en az 50 kadın ve 30 erkek ile bir embriyo toplama kabına doldurmak için yeterli olandan daha fazla. En iyi döşenmesi için, sinek (yani en az 5 gün sonrası kuluçka) yeni eclosed olmalıdır.
2. Kabaca eşit parçaya Red Star aktif kuru maya ve distile su ile küçük bir bardak doldurarak yapıştırın bir maya ve maya eriyene kadar karıştırın. Macun ıslak fıstık ezmesi yaklaşık tutarlılık olmalıdır. Daha fazla maya veya su tutarlılık değiştirmek için eklenebilir. Maya salçası, 4, birkaç gün için kullanılır, ve saklanmalıdır, kapalı ° C
3. Maya yapıştırın hazır olduğunda, 4 elma suyu plakaları kaldırmak ° C depolama. Maya hamuru ile elma suyu plakalar ve bunların 22-25 ısınmasını bekleyin Streak ° C, yumurtlama teşvik edecektir.
4. Sonra yine yarım, yarım yuvarlak bir filtre kağıdı katlayın. 8-9 cm çapında kesin ve çeyrek daire içinde akordeon kıvrımları. Daire açın, invert ve örgü temas edene kadar bir toplama kabına yerleştirin. Sonbahar ve sinek ezmek, böylece kağıt bardak güvenli olduğundan emin olun. Filtre kağıdı, isteğe bağlıdır, ancak çiftleşme için davetkar bir ortam sağlar, ve fincan nem tutar.
5. Stok adı ve tarih ile birlikte bir fincan etiketleyin. Fincan ters şişe hafifçe sallayarak ve hemen hazırlanmış bir elma suyu plaka ile fincan kapağı sineklerin şişe toplama kabına aktarın. Plaka fincan bir lastik bant ile sabitleyin. Doğrudan güneş ışığı ile bir alanda bardak örgü yüzü yukarı ayarlayın. Sinekler karanlıkta yatıyordu olmaz gölgeler, fincan düştüğü emin olun.
6. Elma suyu plakası, gerektiği gibi değiştirin. İki saat koleksiyonları, oda sıcaklığında, görüntüleme cellularization için iyi çalışır.

4. Montaj Odası hazırlayın

1. Embriyolar için bir montaj odası hazırlamak için, 2-3 cm uzunluğunda çift taraflı bant bir parça kesme ve bir slayt üzerine yerleştirin, teyp ve slayt uzun ekseni hizalayarak. Kenarları hizalanır emin olmak için, ikinci bir 2-3 cm, çift taraflı bant ve diğer bant parçasının üstüne katmanı uzun bir parça kesin.
2. Bir jilet kullanarak, bant ve slayt uzun eksenine dik merkezi dışında iki yaklaşık 3 mm keser. Kesimler arasında bir kanal yapmak için bandı çıkarın. Kanal içine Halokarbon 27 Petrol pipetleyin bir damla. Bu kanal, embriyoların burada monte edilecektir.

Notlar:

• Sadece ½ inç Scotch çift taraflı bant, embriyoları yerleştirmek için doğru kalınlığı.
• Halokarbon 27 Yağ oksijen geçirgen ve embriyo dehidratasyon önlerken oksijen alışverişi sağlar. Refraktif indeks nedeniyle, Halokarbon 27 Yağ evreleme için de idealdir.ve görüntüleme embriyolar.

5. Dechorionate Embriyolar

1. Toplamak ve dechorionate embriyolar için, tüm yüzey tamamen daldırın elma suyu agar plaka üzerinde yeterince% 50 çamaşır suyu dökün. Embriyoların koryon serbest bırakmak için, iletilen ışık Zeiss Discovery V8 gibi, bir diseksiyon mikroskop kullanarak izlemek. Koryon gevşetir ve bir kaç embriyolar (30-60 saniye) sürümleri gibi, bir hücre süzgeç içine çamaşır suyu ve embriyolar dökün.
2. Fışkırtma bir şişe saf su ile derhal ve şiddetle süzgeç embriyolar yıkayın. Dab süzgeç kağıt havlu üzerine. Dabbing sonra herhangi bir pembe havlu görüldüğü takdirde, su ile embriyolar yıkama devam etmektedir.
3. Temiz bir elma suyu plaka (maya yapıştırın olmadan) 10-50 embriyo transferine nemli bir fırça kullanın. Yırtık bir kağıt havlu kenarı ile su uzak Wick ve hemen Halokarbon 27 Yağı küçük bir miktarı ile embriyoların kapsayacak.

Notlar:

• Clorox çamaşır suyu kullanmayın. Bunun yerine, <% 6 sodyum hipoklorit Austin Ticaret Bleach, A-1 gibi bir marka kullanın.
• Aşırı ağartma veya yetersiz durulama düzensiz cellularization Duygusal embriyolar neden olacaktır.

6. Sahne ve Montaj Embriyolar

1. Iletilen ışık ile diseksiyon mikroskop kullanarak, plaka üzerinde embriyolar aşamasına Bownes ²⁰ morfolojik yönergeleri izleyin. Forseps kullanarak, montaj odasına kanal Bownes evre 4 karşılık, 5 mitotik döngüsü 11 veya 12 embriyoların transferi. Dorsal ve ventral tarafı aşağı görünür ve yan tarafında bir çizgi embriyolar düzenleyin. Embriyolar yalnız petrol bu yönde kolayca düzenlenir. Kapak kayma aşağıda uygulandıktan sonra oksijen komşuları mahrum kalabalık embriyolar birlikte etmeyin. (Aralarında embriyo uzunluğu yaklaşık yarım bırakın).
2. Kanalın bir tarafında çift taraflı bant kayma 25x25 mm kapak kenarına yatırın. Kanal kapağı için kapak kayma bırakın. Hava altında yakalanmış ise, kapak kayma kenarında Halokarbon 27 Yağı küçük bir miktar uygulanır. Kılcal etkinlik kanal içine yağ çekme ve hava dışarı itecektir.

Notlar:

• Embriyolar evreleme için bir başka mükemmel bir kaynak aşağıdadır: Campos-Ortega, JA ve Hartenstein, V. (1985). Drosophila melanogaster Embriyonik gelişim. Springer-Verlag, Berlin. Bu kitap artık yayınlanmış olmasına rağmen, kullanılan kopya Amazon.com düzenli olarak kullanılabilir.
• Idareli Halokarbon 27 Yağ her zaman kullanın. Bu montaj daha kolay hale getirecektir. Ayrıca aşağıdaki görüntüleme adımları mikroskop objektif üzerine yağ sızmaya yanlışlıkla önleyecektir.

7. Resim Embriyolar

1. Tabii burada Nasıl devam görüntüleme olduğu hücre şekil değişikliği ve size hitap soru tarafından dikte olacaktır. Herhangi bir şekil değişikliği için, montaj odasına ya dik ya da ters mikroskop yere iletilen ışık embriyolar bulmak ve daha sonra bölgeye bir ilgi odağı konfokal görüntüleme geçmek. Nikon'un MicroscopyU (tartışılacak gibi konfokal mikroskopi için en iyi uygulamalar, uyun http://www.microscopyu.com/articles/confocal) . Photobleaching ve fototoksisite önlemek için, mümkün olduğu kadar az lazer gücü, canlı embriyolarının ifşa özellikle dikkatli olun.
2. Cellularization için, biz bir Zeiss 710 lazer tarama konfokal mikroskop görüntü, bir C-Apochromat 40x/1.2 W Corr amacı ile. Bu mikroskop, 18-20 ° C den arasında değişen sıcaklıklarda, sıcaklık kontrollü bir oda içinde yer alır Sıcaklık kontrolü kesinlikle gerekli değildir, ancak mikroskop için daha iyi ve görüntü daha tutarlı hale getirir. Biz düzenli olarak embriyo ortasına yakın tek bir düzlemde görüntü, kesit plazma zarı invajinasyonları (Şekil 2) takip etmek. , Sadece invajinasyon dinamikleri takip için 30-60 saniyelik aralıklarla zaman atlamalı görüntüleme için yeterli ve embriyolar oksijensizlik hiçbir belirgin belirti> 90 dakika için görüntüleme dayanacak.
3. Görüntüleri aldıktan sonra, görüntü analiz paketleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri freeware, ImageJ (adı da dahil olmak üzere herhangi bir sayı kullanılarak analiz edilebilir http://rsbweb.nih.gov/ij). Bu veriler daha sonra film (Film 1), diziler (Şekil 2) veya kymographs ²¹ olarak sunulabilir.

Not:

• C-Apochromat suya daldırma 40x/1.2 W Corr amacı sulu örneklerinde derin doku görüntüleme için sapmaları sınırlar yüksek diyafram nedeniyle orta bölümünde embriyo yakın görüntüleme için çok uygun ve yüksek çözünürlük ve yüksek floresan sinyal verir. Buna ek olarak, bu amacaçok uzun bir çalışma mesafesi (220 mikron). Ancak, diğer su ya da gliserin daldırma hedefleri ilgi hücre şekil değişikliği embriyo yüzeyine yakın görüntülü özellikle iyi bir performans olacak.

8. Alternatif Yöntem: "embriyo-tutkal" Montaj Embriyolar

1. Cellularization daha başka bir hücre şeklini değiştirmek için, belirli bir yönde kolayca tek başına petrol tutulmaz embriyolar monte etmek için gerekli olabilir. Bunu yapmak için, daha önce açıklanan bir alternatif montaj metodu kullanın. Sintilasyon flakon 250 mcL heptan ile 20 cm çift taraflı bant ile birleştirerek "embriyo-tutkal" yaparak başlayın. Sintilasyon bir nutator flakon ya da dönen bir platform yerleştirin ve geceleme karıştırın.
2. Embriyo yapıştırıcı bir sarı pipet ucu batırın ve sonra tutkal bir iz bırakarak, bir slayt boyunca ucu iz. Heptan buharlaşan iken, agar bir blok gerekli yönde embriyolar sahnelenen hizalayın. (Görüntülü embriyo yüzey agar karşı karşıya olması gerektiğini unutmayın. Örneğin, ventral karık oluşumu sırasında görüntü hücre şeklini değiştirmek için, agar karşı karşıya ventral yüzü embriyolar monte edin.)
3. Yapıştırıcı ile slayt, invert ve yavaşça agar bloğu embriyoların karşı tutkal izi basın. Şimdi tekrar slayt çevirin. Embriyolar uygun bir yönlendirmeye sıkışmış olacak. Embriyoların her iki tarafında çift taraflı bant ile iki kat, Halokarbon 27 Yağ kapağını ve bir lamel geçerlidir. Yukarıda açıklandığı gibi görüntüleme ile devam edin.

9 - Temsilcisi Sonuçlar:

Embriyoların sağlıklı ve en iyi görüntü ise, daha sonra cellularization 50-60 dakika almalı ve plazma membran invajinasyonları girişine yaklaşık 40 mikron. Ancak, embriyolar üzerinde ağartılmış, fototoksisite tarafından oksijen yoksun veya hasarlı olup olmadığını, daha sonra invajinasyon ya özellikle görüntülü alanda, yavaş ya da duracaktır. Embriyo sağlık Böyle bozulma, sık sık değişmiş geliştirme ve larva olarak yumurtadan bir başarısızlık ile sonuçlanır. Böylece, görüntüleme sonra tahlil embriyo sağlık için sıkı bir test için, nemlendirilmiş bir odasında slaytlarınız tutmak ve ertesi gün kuluçka izlemek.

Şekil 1. Embriyo toplama görüntüleme iş akışı, iş akışı protokol dört ana aşamaya bölünebilir . İlk aşamada, tüm bireysel kaynakları ve bileşenleri hazırlanır ve daha sonra embriyo toplama fincan elma suyu agar plaka ve GFP sinekler embriyo-döşeme ortamı yaratmak için bir araya konur. İkinci aşamada ise, elma suyu agar plakları üzerine koydu, yumurta ve embriyolar toplanır. Üçüncü aşamada ise, embriyoların plaka kaldırılır, sahnelenen ve montaj odasına aktarılır. Dördüncü evrede, monte embriyolar konfokal mikroskop görüntülü.

Şekil 2. Cellularization zaman atlamalı görüntüleme Temsilcisi veri Embriyolar dorsal (D) ve açıkça görünür ventral (V) taraf ile monte edilir ve kesit plazma zarı invajinasyonları takip etmek onların ortasına yakın görüntülü. Burada gösterilen embriyo ifade GFP-Myosin-2 prob ^6, plazma zarı invajinasyonları ucunda yoğunlaşmaktadır. Böylece, zamanla bu ön ingression izleme plazma zarı invaginates hangi hızda verir. 0:00 dakika zaman noktası cellularization başlangıçlı karşılık gelir. 56:00 dakikalık bir zaman noktasında kısa bir süre sonra, gastrulasyon embriyonun ventral tarafında başlar. Bar 40 mikron.

Movie 1. Cellularization zaman atlamalı görüntüleme Temsilcisi film Bu film Şekil 2 tekabül etmektedir. , Görüntüleme cellularization tüm süreci kaydetmek için yakalama pseudocleavage karık regresyon, önceki mitotik döngüsü 13 başladı ve gastrulasyon hareketleri embriyonun ventral tarafında görüldü kadar devam etti. Görüntüler bir dakikalık aralıklarla toplanmıştır. Şiddetleri gastrulasyon hareketleri daha kolay hale getirmek için alım sonrası artmıştır.
Video için tıklayın

* Gelişimsel olay ve zamanlama	Hücre şekil değişiklikleri ile ilgili	Hastalık ya da insan sağlığı için bir bağlantı	Canlı görüntüleme ile son referanslar
Pseudo-bölünme karık oluşumu (4, 90 dakika pf)	Sitokinez	Poliploidi ve kanser ilerlemesi 1	Mavrakis ve ark, 2009 8 Cao ve ark, 2010 9
Cellularization (5, 130 dakika pf)	Sitokinez	Poliploidi ve kanser ilerlemesi 1	Cao ve ark, 2008 10 Sokac & Wieschaus, 11, 2008
Ventral karık formasyonu; Mezoderm invajinasyon (6, 180 dakika pf)	Apikal daralma; Epitel mezenkimal geçiş	Kanser metastaz 2	Fox & Peifer, 12, 2007 Martin ve ark, 2009 13
Germband uzantısı (7, 195 dakika pf)	Yakınsak uzantısı	Nöral tüp defektleri 3	Bertet ve ark, 2004 14 Blankenship ve ark, 2006 15
Tracheogenesis (11, 320 dakika, pf)	Epitelyal tüp oluşumu ve dallanma	Anjiyogenez 4	Caussinus ve ark, 2008 16 Gervais & Casanova, 2010 17
Dorsal kapatma (14, 620 dakika pf)	Apikal daralma	Yara iyileşmesi 5	Gorfinkiel ve ark, 2009 18 Solon ve ark, 2009 19

Yaşayan sinek embriyolar görüntülü cep şekil değişiklikleri Tablo 1.
* Bownes sahne sayısı ve süresi sonrası fertilizasyon (pf), her olay başladığında, Campos-Ortega, 1985 göre sıralanmıştır.

Stok Fly	Etiketler	Orijinal referans
Spider-GFP (95-1)	Plazma membran	Morin ve ark, 2001 22
Resille-GFP (117-2)	Plazma membran	Morin ve ark, 2001 22
GAP43-Venüs	Plazma membran	Mavrakis ve ark, 2009 8
Spagetti Squash GFP (SQH-GFP)	Miyozin-2	Royou ve ark, 2002 6
E-kaderin-GFP (ECAD-GFP)	Hücre-hücre kavşaklar	Oda ve ark, 2001 23
GFP-Moesin	F-aktin	Kiehart ve ark, 2000 24
Utrophin-Venus (Utro Venüs)	F-aktin	Sokac ve ark. Yayınlanmamış sonuçları

Tablo 2 sinek embriyolar görüntüleme hücre şekil değişikliği Faydalı stokları

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Protokol, burada, gelişmekte olan sinek embriyonun hücre şekil değişiklikleri bir dizi canlı, konfokal görüntüleme izin verecektir nitelendirdi. GFP stokları görüntüleme için ayrı bir laboratuvar (Tablo 2) tarafından hazırlanan, ancak pek çok hisse senedi de Indiana Üniversitesi'nden (Bloomington Drosophila Menkul Kıymetler Merkezi olarak merkezlerinin halka açık olabilir http://flystocks.bio.indiana.edu) ve flytrap Yale Üniversitesi (Men...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slides	Fisher Scientific	12-550-343
Cover slips 25x25	Fisher Scientific	1 2-524C
Squirt bottles (H2O)	Fisher Scientific	02-897-11
50 ml Falcon tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Bulbs for small pipets, 1 mL	Fisher Scientific	03-448-21
Scintillation vials with caps	VWR international	66021-533
Tri-Corn Beakers, 100 mL	Electron Microscopy Sciences	60970
BD Falcon Petri dish 60x15mm	Fisher Scientific	08757 100B
BD Falcon Cell strainer	Fisher Scientific	08-771-2
Yellow pipet tips	Rainin	L200
Stainless steel mesh, 304, 12x24	Small Parts, Inc.	CX-0150-F-01
Glass 5¾ inch Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20B
P4 Filter paper	Fisher Scientific	09-803-6F
Rubber bands	Office Max	A620645
Scotch double-sided tape, ½ inch	Office Max	A8137DM-2
Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2	Jerry’s Artarama	56460
Dumont #5 Forceps High Precision Inox	Electron Microscopy Sciences	72701-DZ
Razor blades	VWR international	55411-050
Halocarbon Oil 27	Sigma-Aldrich	H 8773
Heptane	Fisher Scientific	H360-1
BD Bacto Agar	VWR international	90000-760
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
p-Hydroxybenzoic acid	Sigma-Aldrich	H5501
Red Star Active Dry Yeast	LeSaffre	15700
Paper towels, C-fold	Kleenex
Heavy duty aluminum foil	Reynolds Wrap
Bleach	Austin’s A-1 Commercial
100% Apple juice	Ocean Spray or Tree Top