Cilt Mekanizmaları belirleme Sipariş Değişken konsantrasyon İzotermal Titrasyon Kalorimetre Veri Kümeleri toplanıyor

Özet

ITC, ev sahibi bir ligand bağlama eğitimi için güçlü bir araçtır. Ancak karmaşık sistemler, çeşitli modeller eşit derecede iyi veriler uygun olabilir. Burada anlatılan yöntem kompleks sistemler için uygun bir bağlama modelini aydınlatmak ve ilgili termodinamik parametreleri ayıklamak için bir araç sağlar.

Özet

Izotermal titrasyon kalorimetri (ITC) yaygın bir ana makromolekül bir ligand bağlama ile ilgili termodinamik parametreleri belirlemek için kullanılır. ITC konak / ligand etkileşimleri çalışmak için ortak spektroskopik yaklaşımlar üzerinde bazı avantajları vardır. Örneğin, serbest ya da iki bileşenden etkileşime girdiğinde emilir ısı doğrudan ölçülür ve herhangi bir eksojen gazetecilere gerektirmez. Bu nedenle bağlayıcı entalpi ve dernek sabiti (Ka), ITC verileri doğrudan elde edilen ve entropik katkısını hesaplamak için kullanılabilir. Ayrıca, izoterm şekli c-değeri ve katılan mekanistik model bağlıdır. C-değeri olarak tanımlanır c = n [P] TKA, [P] t protein konsantrasyonu ve n ev sahibi içinde ligand bağlayıcı sitelerinin sayısı. Pek çok durumda, belirli bir ligand için birden fazla bağlayıcı siteleri denk olmayan ve ITC, her bir bağlanma yeri için termodinamik bağlayıcı parametrelerinin karakterizasyonu sağlar. Ancak bu doğru bağlayıcı model gerektirir. Bu seçim, farklı modeller aynı deneysel verilere uygun eğer sorunlu olabilir. Biz daha önce bu sorunu c-değerleri çeşitli deneyler yaparak atlatılabilmişlerdir olabileceğini göstermiştir. C-değerleri farklı elde birden fazla izotermleri ayrı model aynı anda bir uyum vardır. Doğru model sonraki tüm değişken c veri kümesi arasında uyum iyiliği göre tespit edilir. Bu süreç, aminoglikozid direnci neden olan enzimi aminoglikozid N-6'-asetiltransferaz-Ii (AAC (6 ')-Ii) burada uygulanır. Bizim metodoloji herhangi bir sistem için geçerli olmakla birlikte, bu stratejinin gerekliliği daha iyi allostery veya cooperativity gösteren bir makromolekül-ligand sistemi ile gösterdi ve farklı bağlama modelleri aynı veri aslında aynı uyan. Bildiğimiz kadarıyla, piyasada bulunan böyle bir sistem vardır. AAC (6 ')-Ii, iki alt arasındaki cooperativity gösteren iki aktif siteleri içeren bir homo-dimer. Ancak tek bir c-değeri elde ITC verileri eşit derecede iyi iki-setleri-siteleri bağımsız model ve sıralı bir iki yerinde (kooperatif) modeli en az iki farklı modelleri uygun olabilir. Yukarıda açıklandığı gibi c-değeri değişen sayesinde, doğru bağlama modelini AAC (6 ')-Ii iki site sıralı bağlama modelini olduğunu kurulmuştur. Burada, biz ITC deneyler yaparken değişken c analizler için uygun veri setleri elde etmek için atılması gereken adımları açıklar.

Protokol

1. Stok çözelti hazırlanması

1. Ilgi makromolekül arındırın. (Bu durumda, başka rapor gibi aminoglikozid N-6'-asetiltransferaz-Ii (AAC6' Ii), izole edilmiştir. ¹³⁾
2. 4 litre diyaliz tampon hazırlayın. (Bu durumda 25 mM 4 - (2-hidroksi)-1-piperazineethanesulfonic asit (Hepes MW 238,3 g / mol), 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA, 292,2 MW) içeren, pH 7.5.)
3. Protein AAC (6 ')-Ii örneği (400 mcM az 5 ml) kullanılan diyaliz tampon (3 x 1.3 L) diyalize olmalıdır Dialyze. Son diyaliz solüsyonu makine durulama ve örnekler sulandırmak için tutulur.
4. 0.45 mikron selüloz filtre ile son diyaliz solüsyonu Filtresi ve 4 ° C'de saklanan 'Çalışan tampon' olarak sevk edilecektir
5. Akan tamponu ile iyice durulanması, 0.2 mikron şırınga filtre süzülür protein çözüm. Standart bir test (Bradford, Lowry, vb) veya UV absorbans kullanarak protein nihai konsantrasyonu ölçün. Uzun vadeli istikrar en üst düzeye çıkarmak için protein saklayın. (AAC (6 durumda)-Ii dondurma ve çözme sonra faaliyet korumak değildir ')-Ii, bu depolama 4 ° C AAC (6 anlamına gelir').
6. Tampon çalışan 4,0 mg eriterek asetil koenzim A 25 mM stok solüsyonu (AcCoA, ligand, 809,57 MW) 200μL hazırlayın. , -78 Anda Freeze ° C Kullanıma hazır olana kadar.
7. Tüm protein ve ligand örnekleri, konsantrasyon rastgele örnek-örnek dalgalanmaları en aza indirmek için, aynı stok çözümleri geliyor olmalıdır. Tüm değişken-c veri kümesi üzerinde protein konsantrasyonu için tek bir düzeltme faktörü analiz ayarlanır. ¹⁰

2. ITC numunelerin hazırlanması

1. 2 mL nihai hacmi ile 64 arasında bir c değeri enzim çözeltisi seyreltilir. (AAC (6 ')-Ii olması durumunda, bu 192 mcM karşılık gelir.)
2. Buz su ligand (AcCoA) stok solüsyonu hızla çözünme.
3. Bir AcCoA çözüm 0.5 ml 10 kat daha fazla konsantre sonra bu durumda protein bağlayıcı sitelerinin sayısı, tampon çalışan 420 mcL AcCoA stok solüsyonu 80 mcL seyreltilmesi ile 4 mM. Hazırlayın Bir pipetle dolum tüpü içine aktarın. Hızla -78 ° C AcCoA stok solüsyonu geri
4. Degas bir sıcaklık 1 ile 5 dakika boyunca protein ve vakum altında çözümler ° C istenilen çalışan sıcaklık altında (19 ° C).

3. Şırınga ayarlama ¹⁴

1. Önceden monte edilmiş şırınga kelepçe sahibi olarak aynı yüksekliğe kadar şırınga tutucu ile enjeksiyon şırınga takın.
2. Şırınga sahibinin alt sıkıca bastırılır kadar enjeksiyon şırınga üzerinden ikinci şırınga kelepçe besleyin. Sağlanan 0.050 "Tükenmez Hex Sürücü ile kelepçe yavaşça sıkın.
3. Şırınga tutucu pipet tutucu içine yerleştirin.
4. Pipet enjektör enjeksiyon enjektör içine yavaşça kaydırın. Piston ucu şırınganın deliğe doğrudan beslenen emin olun. Bir kez tam yerleştiğinden, pipet enjektör içine şırınga sahibinin kilitleme yaka vida.

4. ¹⁴ örnek hücre yükleme

1. Tampon çalışan en az 50 ml örnek hücre yıkayın ve uzun Needled 2.5 ml cam şırınga kullanarak kalan herhangi bir sıvı kaldırmak.
2. Yavaş yavaş, temiz ve kuru uzun Needled 2.5 ml şırınga içine protein örnek solüsyon en az 1.8 ml çizin. Kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olun.
3. Iğne örnek hücre dikkatlice yerleştirin ve hafifçe hücrenin altındaki dokunun. Ucu hafifçe kaldırın (~ 1 mm) ve hücre içine aşırı sıvı örnek hücrenin üst üstünde görünür oluncaya kadar yavaşça AAC (6 ')-Ii çözüm enjekte.
4. Taşma sıvı kalıntıları sağlarken 1 cm iğne yavaşça kaldırın. Hızla geri çekilmesi ve Örnek hücresi içinde sıkışan kabarcıkları kaldırmak için çözüm küçük bir miktar (~ 0.25 ml) enjekte edilir.
5. Tüm çözüm taşması çıkarın. Bu örnek hücre içine hafifçe taşması kenarı boyunca iğne sürgülü elde edilir. Şırınga ucu bir çıkıntıya vuracaktır, bu, çalışan bir çözüm için arzu yüksekliği. Bu çizginin üstünde oturan tüm sıvı çıkarın.

5. Yükleme ve enjeksiyon şırınga vadede ¹⁴ başlatılması

1. Plastik tüp yükleme şırınga dolgu portuna takın.
2. Alt-üst dolgu liman piston ucu.
3. Pipet tutucu altındaki tüp dolum pipet AcCoA çözüm yerleştirin. Şırınga ucu dolum tüpü alt temas etmemelidir.
4. Küçük bir miktar yükleme şırınga tüp girene kadar yavaşça enjektöre çözüm çizin.
5. Piston ucu tıklatın ve Kapat Dolgu Port düğmesine düşürerek doldurma portu kapatın. Temizle ve dolum, herhangi bir hava kabarcığı kaldırmak için Temizle-> Yedek düğmesine 3 kez tıklayarak yükleme sırasında tuzak haline olabilir.
6. Pipet tutucu dolum tüpü çıkarın ve şırınga ucu hafifçe silin.
7. Örnek hücre içine pipet montaj ve hafifçe daha düşük şırıngaya çekin. Şırınga kolayca viraj gibi yavaş yavaş devam edin, büyük bir titizlikle ihtiyaç vardır. Şırınga tamamen yaka kilitleme baz bastırarak takılı olduğundan emin olun.
8. İstenen çalışan sıcaklığı (20 ° C Bu durumda) ayarlayın ve (bu durumda 20μcal/sec) beklenen maksimum enjeksiyon ısı akışı biraz daha fazla bir referans güç seçin.
9. İstenen enjeksiyon hacimleri ve gecikmeler Programı. (Bu durumda, 28 enjeksiyonları istihdam edilmiştir. Ilk enjeksiyonu 60 sn gecikme ile 2 mcL hacmi vardı. Sonraki tüm enjeksiyonları ile 10 330 ler gecikmeler mcL hacimleri vardı.)

6. Müteakip çalışır

1. Sonraki tüm çalışır 2,4,8,16 bir faktör AAC (6 ')-Ii ve AcCoA konsantrasyonları azaltırken, 2-5 arasındaki adımları tekrarlayın ve 32.

7. Veri Analizi

1. Küresel bağlayıcı parametreleri tek bir set tüm izotermleri uyan uyan yordamı kullanın, daha ^önce 10 tarif .

8. Temsilcisi Sonuçlar

Temsilcisi veriler Şekil 1'de gösterilmiştir. Izotermleri şekiller konsantrasyon farklı olmalıdır. Üstü için keskin geçişleri bekleniyor c-değerleri (yani yüksek protein ve ligand konsantrasyonları) (Şekil 2).

AAC (6 ')-Ii durumda, iki site sıralı modeli açıklayan iki takım, ayarlanabilir stoichiometries ile aynı, bağımsız sitelerin birden daha iyi bir uyum sağlar.

Şekil 1, AAC (6 ')-Ii (192 mcM) AcCoA titrasyonu (3.86 mM) tarafından üretilen İzotermleri . A) Ham ITC iz. B) 2-sitesi sıralı uyum (bağlama parametreleri (kareler) belirlemek için kullanılan Entegre değerleri -).

AcCoA Şekil 2 ITC izotermleri değişik konsantrasyonlarda AAC (6 ')-Ii içine titre. Deneysel veriler (açık çevrelerin), 2-setleri-siteleri bağımsız model (kesikli kırmızı) ve 2-site sıralı modeli (düz mavi) için uygun. 2-site sequentional modeli açıkça daha iyi bir genel anlaşma verir. Istihdam konsantrasyonları), 6 mcM, 0,25 mM, B) 12 mcM, 0.25 mM, C) 24 mcM, 0.5 mM D) 48 mcM, 1.0 mM, E) 96 mcM, 1.9 mM ve F) 196 mcM sırasıyla AAC (6 ')-Ii ve AcCoA için 3.86 mM.

Tartışmalar

Bu değişken c uydurma analitik bir kısmı daha önce ^ayrıntılı 10 tarif edilmiştir . İşte biz, bu yaklaşım için uygun değişken-c veri setleri toplama pratik yönlerini rapor. Bu protein ve ligand örnekleri aynı stok çözümleri çizilmiş olması esastır. Bu nedenle yeterli stok solüsyonu deneylerin tüm seriyi tamamlamak için başlangıçta hazır olduğunu önemlidir. Bu oranı AAC (6 ')-Ii sağlar ve AcCoA tüm deneyler arasında sürekli ve rastgele bir örnek-örnek bazında konsa...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetyl c–nzyme A (AcCoA)	Sigma-Aldrich	A2056
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Fisher Scientific	7365-45-9
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	431788
Spectra/Por 2 Dialysis Tubing	Spectrum Labs	132678
Sterile Syringe Filter (0.2 μm)	VWR international	281445-477
Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm)	Whatman, GE Healthcare	7184-004
VP-ITC	MicroCal	VP-ITC	Microcalorimeter used for measurements
ThermoVac	MicroCal	USB Thermo Vac	Temperature Controlled Degassing Station