HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Özet

HIV tropizm viral zarf V3 bölge anlaşılmaktadır. V3 PCR, iç içe geçmiş RT-PCR, sıralı kullanarak üç nüsha olarak amplifiye ve biyoinformatik yazılımı kullanılarak yorumlanır. Örnekleri dizisi G2P puanları düşük olan 1 veya daha fazla (ler) ile non-R5 virüsü olarak sınıflandırılır.

Özet

Amaç: HIV tedavisi CCR5-antagonist sınıf bir ilaç almak için önce onun viral nüfus hücresel giriş için alternatif bir coreceptor CCR5 coreceptor kullanır ve bu onaylamak için, bir hastanın HIV tropizm testi geçmesi gerekir. Tropizm test edilmesine yönelik bir yaklaşım coreceptor etkileşim HIV zarf, V3 bölgenin sırasını incelemek için.

Yöntemleri: viral RNA kan plazmasından elde edilir. V3 bölge, iç içe geçmiş bir ters transkriptaz-PCR ile üç nüsha olarak yükseltilir. Ilâvelerle sonra sıralı ve yazılım, RE_Call kullanılarak analiz edilmektedir. Diziler sonra V3 bölge viral tropizm anlaması için böyle geno2pheno gibi bir biyoinformatik algoritmasına sunulur. Diziler geno2pheno yanlış pozitiflik oranı% 5.75 altına düşerse non-R5 anlaşılmaktadır. Bir örneklem üzerinden üç dizileri herhangi bir non-R5 anlaşılmaktadır ise, hastanın bir CCR5-antagonist yanıt vermek olası değildir.

Protokol

Prosedür:

1. Ekstraksiyon:

Kan plazması en az 500 mcL bu genotipik HIV tropizm testi için örnek girdi olarak ihtiyaç vardır.

1. HIV RNA easyMAG (bioMérieux) otomatik çıkarıcı ya da laboratuvar tercih edilen ekstraksiyon yöntemi kullanılarak plazma 500μL ayıklayın.
   60 mcL kısım çıkarılan viral RNA elute. -20 Santigrat derece veya hemen çıkardıktan sonra Transcriptase-PCR Ters başlamak saklayınız.

2. RT-PCR:

Örnek ekstraktının 4μL iç içe RT-PCR yöntemleri kullanarak üç nüsha olarak yükseltilecek. RT-PCR reaksiyonu PCR temiz oda ayarlanması gerekir.

1. Yükseltilecek numune sayısı için gerekli reaktif miktarını hesaplayın. 1 reaksiyon için reaktif hacimlerini gösteren aşağıdaki tabloyu uygulayın.
   

   Reaktif	Hacim (mcL) (1X tepki)
   DEPC su tedavi	10,56
   2x reaksiyon tamponu	20
   % 50 ve 0.04% sakaroz Bromophenol mavi karışımı	4
   HIV V3 bölgeyi hedefleyen İleri astar	0,32
   Ters astar	0,32
   Enzim - Üst Simge III Platinum Taq DNA Polimeraz Bir Adım RT-PCR Sistemi	0,8
   Toplam	36

   Tablo 1: Bir Adım RT PCR 1 reaksiyon için gerekli Reaktif hacimleri.
   Her biri bir adım RT-PCR reaksiyonu aşağıdaki tarifi gerektirir:
   • 10.56 mcL DEPC arıtılmış su
   • 2x reaksiyon tamponu 20 mcL
   • % 50 ve 0.04% sakaroz Bromophenol mavi karışımı, 4μL
   • HIV V3 bölgesini hedefleyen ileri astar 0.32 mcL
   • Ters astar 0.32 mcL
   • 0.8 mcL enzim
   36μL başına reaksiyon toplam.
2. Boş bir yanında bir satır örnek özü tüpler kadar Hattı, 96-PCR plate etiketli.
3. Tekrarlayıcı pipet kullanarak, her bir örnek ayıklamak için hazırlanan 3 kuyu olduğunu, PCR plaka her iyi 36 mcL örnek karışımı ekleyin.
   * Not: Bu prosedür, viral nüfusun yeterli örnekleme sağlamak için en az üç nüsha halinde olmalıdır.
4. 8 kanallı, çok kanallı pipet kullanarak, her 3 kuyu örnek ekstraktının 4μL ekleyin. Her yanı sıra arasındaki ipuçları değiştirin.
5. PCR strip kapaklar kuyuları örtün.
6. Transferi comlete olduğunda, bir PCR PCR tabak koyun. Aşağıdaki program ile çalıştırmak için PCR Set 30 dakika: 52 ° C 2 dakika 94 ° C - 40 devir (94 ° C, 55 30seconds ° C ile 1.5 dakika az 68 ° C) 5 dakika 68 az 15 saniye ° C
7. PCR PCR plaka çıkarın. Plaka oda sıcaklığında saklanabilir.

Ikinci tur PCR adıma geçin

3. İkinci tur PCR:

1. Yükseltilecek numune sayısı için gerekli reaktif miktarını hesaplayın. 1 reaksiyon için reaktif hacimlerini gösteren aşağıdaki tabloyu uygulayın.
   

   Reaktif	Hacim (mcL) (1X tepki)
   DEPC su tedavi	13,45
   % 60 sakaroz,% 0.08 kresol kırmızı karışımı	2
   Roche HiFi sistemi Tampon 2	2
   MgCl 2	0,8
   dNTP	0,16
   İleri PCR primer	0,15
   Ters PCR primer	0,15
   HiFi enzim genişletin	0,29
   Toplam	19

   Tablo 2. Reaktif hacimleri ^2. turda PCR 1 reaksiyon için gereklidir.
   Her ikinci tur PCR reaksiyonu aşağıdaki tarifi gerektirir:
   • 13.45 mcL DEPC arıtılmış su
   • 2 mcL% 60 sakaroz,% 0.08 kresol kırmızı karışımı
   • Roche Hifi sistemi Tampon 2 2 mcL
   • 25 mM MgCl ₂ 0.8 mcL
   • 25 mM dNTP 0.16 mcL
   • 0.15 mcL hem ileri ve geri PCR primerleri
   • 0.29 mcL genişletin HiFi enzim
   Toplam reaksiyon başına 19 mcL.
2. PCR temiz oda, tekrarlayıcı pipet kullanarak, temiz bir PCR plate reaksiyon tamponu 19 mcL ortalama eklemek.
3. Yazılan amplifikasyon odası, 8 kanallı, çok kanallı pipet kullanarak, ikinci tur PCR tampon içine RT-PCR şablon 1 mcL aktarın. Her yanı sıra arasındaki ipuçları değiştirin.
4. PCR şerit kapakları ile kuyuların Kapak ve bir termalcycler ikinci tur PCR plaka transfer.
5. Aşağıdaki program ile çalıştırmak için PCR ayarlayın: 2 dakika 94 ° C 35 siklus (15 saniye 94 ° C'de 30 saniye, 55 ° C, 1 dakika 72 ° C) 7 dakika 72 ° C
6. Sıcaklık 25 döndüğünde PCR plakasını çıkarın ° C

4. Jel Elektroforezi:

V3 bölge başarıyla amplifiye olduğunu teyit etmek amacıyla, bir jel elektroforezi adım yapılır.

1. 1X TAE Tampon 50 ml agaroz toz 0.8 g agaroz jel hazırlayın. Karıştırın ve agaroz tamamen eriyene kadar yaklaşık 1 dakika veya mikrodalga eritebilir.
2. SYBR güvenli leke jel ve karıştırmak için girdap 6 mcL ekleyin.
3. Çözüm jel tepsiye dökün ve PCR kuyuların sayısını karşılamak için yeterli jel tarak ekleyin.
4. Jel kuruduktan sonra, taraklar çıkarın ve jel aparat jel, tamamen 1X TAE tampon batık emin olun.
5. 10 mcL çok kanallı pipet kullanarak, jel kendi kuyu her PCR örneklerinin 8μL ekleyin. Ilâvelerle jel eklendikten sonra PCR plaka Kapak.
6. Satır başına en az bir DNA merdiveni 6 mcL ekleyin.
7. Bantların jel tüketmemek emin olun, ~ 10 dakika ~ 100V jel aparat çalıştırın.
8. UV trans-aydınlatma üzerine jel yerleştirin ve jel bir resim çekmek.
   PCR-amplifiye DNA ile Wells, başarılı bir amplifikasyon gösteren, ışık görünecektir.
9. Üç ilâvelerle başarı tüm örnekleri not edin. Gerekirse, 3 ilâvelerle daha az olan bu örnekler için RT-PCR tekrarlayın.

Sıralama ile devam

5. Sıralama:

CDNA viral amplifiye ettikten sonra, örnekler, sıralama için hazırlanabilir. Sıralama reaksiyon sonrası bir amplifikasyon oda yer almalıdır.

1. Buzdolabı, derin dondurucu ve sıralama primerler BigDye çıkarın. 1 saatten daha uzun süre oda sıcaklığında BigDye çözülme edelim.
2. Çalıştırmak numune sayısı için gerekli reaktif miktarını hesaplayın. 1 reaksiyon için reaktif hacimlerini gösteren aşağıdaki tabloyu uygulayın.
   

   Reaktif	Hacim (mcL) (1X tepki)
   BigDye	0,3
   BigDye Tampon	2,1
   Astar boya	2,6
   Toplam	5,0

   Tablo 3. Reaktif hacimleri sıralama 1 reaksiyon için gereklidir.
   * Not: her biri astar için ayrı bir karışım hazırlamak.
   ** Not: sıralama tepki olarak kullanılan BigDye Tampon aşağıdaki gibi hazırlanabilir: Mix Trizma hidroklorür tampon çözelti (1 M) (pH9.0) ve Magnezyum Klorür 0.125 mL (1 M) 17.5 ml. Son hacim distile su ile 100 mL ye getirin. Bu 2-8 ° C'de muhafaza edilmelidir
3. 3.3 hesaplamalarla, sıralama reaksiyon en fazla 5 saniye süreyle her astar ve vorteks karışımları hazırlayın. 0.2mL şerit tüpler içine kısım.
4. Reaksiyon karışımı, çok kanallı pipet kullanarak uygun plaka kuyulara sıralama kısım 5 mcL. Kapak Kimwipe ile sıralama reaksiyon karışımı içeren plaka (lar) ve bir kenara koyun.
5. 01:15 amplifiye PCR ürünü bir seyreltme kalan PCR ürünü 180 mcL Baxter steril su ekleyerek hazırlayın.
6. Pipet 1 mcL uygun plaka kuyuların dibine seyreltilmiş numune, pipet uçları değiştirin.
7. Örnek transferi bittiğinde, 1 saniye için şerit kapaklar ve vorteks ile plaka mühür
8. Santrifüj plaka koyun. Dönüş hızı 145g ulaşır 145g, hız, spin durdurun.
9. Aşağıdaki program ayarlanmış bir PCR (ler) plaka Yeri: 25 devir (10 sn @ 96 ° C, 5 sn @ 50 ° C, 55 sn @ 60 ° C...) Hacmi olmalıdır en azından 6μL . Döngüsü yaklaşık 1.2 saat sürer.

Çökelmesi devam

6. Yağış:

"Clean-up" sıralama reaksiyon aşağıdaki viral cDNA etanol yağış,% 95 etanol kullanarak gerçekleştirebilirsiniz.

1. PCR plakasını alın ve bir post-kuvvetlendiricileri getirmekbahsedilmekte oda.
2. Şerit kapaklarını çıkarın ve temiz bir kağıt havlu veya Kimwipe sırayla yerleştirin.
3. Çalışma EDTA-Sodyum Asetat her numunenin yan Çözüm Pipet 4μL. Plaka hafifçe kadar EDTA-Sodyum çözüm kuyunun dibine düşer dokunun. Kuyunun dibinde örnek temas etmemesine olarak aynı ipuçları, bu kadar uzun süre kullanılan olabilir.
   * Not: çalışma EDTA-Sodyum Asetat çözümü aşağıdaki gibi hazırlanabilir:
   1. Distile su 1 L, 246.1 g Sodyum Asetat eriterek 3M Sodyum Asetat hazırlayın. 0.45 mikro filtre ile çözüm Filtre ve 50 ml alikotları hazırlamak.
   2. Sodyum Asetat (3 M) ve EDTA çözeltisi (500 mM) pH 8.0 eşit hacimlerde karıştırılarak Menkul Kıymetler EDTA-Sodyum Asetat Çözeltisi (1.5 M NaOAc, 250 mM EDTA) hazırlayın.
   3. Distile su (10 ml + 30 ml) EDTA-Sodyum Asetat Çözüm üç bölümden bir parça stoku karıştırılarak EDTA-Sodyum Asetat Çözüm çalışma hazırlayın.
4. Pipet 40μL örnek kuyuların karşı tarafa üzerine ve soğutulmuş% 95 etanol şerit kapaklarını değiştirin.
5. Kapaklar ve 10 saniye boyunca plaka vorteks Seal. Herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için plaka dokunun.
6. -20 ° C'de derin dondurucuda en az 30 dakika ve en fazla 2 saat bir tabak koyun.
7. 1. Plaka yağış meydana geldi sonra, 3700 rpm'de 20 dakika santrifüj dondurucu ve yerden kaldırmak.
   2. Denatürasyon önce Çözülme izin Hi-Di Formamide (Applied Biosystems) uygun miktarda dondurucuya kaldırın.
   * Not: tam 96 plaka Denatürasyon Hidi Formamid 960μL gerektirir ve bu nedenle önceden ~ 1.1mL alikotları hazırlamak için avantajlıdır.
8. Plaka iplik sonra çıkarın ve şerit kapağı atmak. Atık kabını (örn. çöp kutusu) ve süzün süpernatantı üzerinden plaka tersine çevirin. Kağıt havlu üzerine ters çevrilmiş tabak blot kalan tüm süpernatant kurtulun.
9. Plaka yüzeyinde 2 yaprak kağıt havlu ve yer katlayın. 145g ulaştığında spin durdurarak, 145g, santrifüj ve spin plaka yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
10. Santrifüj plaka çıkarın ve kuyu boş emin olmak için kontrol edin. Kuyu içine soğutulmuş% 95 etanol Pipet 155μL.
11. Süpernatantı atık konteyneri ve kağıt havlu üzerine leke içine atın ve 4.10 'da santrifüj tekrarlayın.
12. Santrifüj plaka kaldırılması üzerine, kağıt havlu atmak ve plaka herhangi bir kalan etanol buharlaşması için 2-5 dakika boyunca yüz ayağa sağlar.

Denatüre için devam edin

7. Denatüre

1. Bir çok kanallı pipet için yeterince büyük bir kabın içine çözülmüş Hidi Formamid ve süzün Al,
   * Not: 6.7b de belirtildiği gibi ön aliquoted önlemler kullanıyorsanız, bir tüp çalıştırılmak üzere her biri 96-plaka için gerekli olan.
2. Plaka, çok kanallı pipet kullanarak, boş olanlar da dahil olmak üzere, tüm kuyulara Hidi Formamid 10μL dağıtmak.
3. Bir mühür formu septalar mat plaka Kapak.
4. 2 dakika süreyle 90 ° C'de bir termalcycler plaka koyun.
5. Denatürasyon ardından, bir plaka sahibi plaka sonra sequencer yüklemek. Hazırlanmış bir sıralama düzeni yükleyin. Tabaklar sıralama vadede gerçekleştirmeden önce bir hafta kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.

8. Base Arayan Yazılımı kullanarak Sonuç Veri Analizi.

1. Hiçbir insan müdahalesi olmadan otomatik baz çağıran hatırlama kullanarak gerçekleştirmek, tek astar kapsama kabul edilir. Hatırlama, aşağıdaki URL adresinden bulunabilir, özel bir üs görüşme yazılımı: http://pssm.cfenet.ubc.ca/
   * Not: Bir hesap giriş için gerekli. Bir hesap açtırmak için, giriş sayfasında bulunan "Kayıt Ol" düğmesini tıklatın. Bir hesap yükleme sayfasına erişmek yaratılmıştır.
2. Giriş yaptığınızda, yüklemek için örnek dosyaları seçebilirsiniz. Browse seçeneği kullanarak maksimum 20Mb yükleme yüklemek için ham sıralama veri bulabilirsiniz.
   * Not: Web Geri Çağırma... Sadece bir zip ABİ ve SCF dosyaları gibi veri dosyaları kabul eder, tar veya tar.gz dosyası
3. Yüklemek için dosya seçildikten sonra, referans dizisi seçin. Bu durumda, referans dizisi için ayarlanmış olduğundan emin olun 'V3.' Şimdi tıklayın hazırız "Süreç Verileri."
4. İşlenmiş veri başlığı altında, sayfanın sağ tarafında görünecektir "Geçmişten örnekleri." Işlenmiş Her çalıştırmak veya numune seti tarih etiketli bir klasör alınacaktır. Bunlar "Rename" butonuna tıklayarak yeniden etiketli olabilir.
5. Klasörüne tıkladığınızda örnek bir listesini getirecektir. Kırmızı olanlar başarısız oldu; yeşil geçti. Belirli bir örnek ve "Göster" butonuna tıklayarak, sırasını gözden geçirmek için mümkün. Throu gezinmek için sayfanın sağ tarafında yönergeleri izleyin.gh dizisi.
   * Not: Bu yöntem için, elle müdahalesi olmadan, otomatik olarak (yeşil renkte) geri çağırma geçen dizileri ihracat kabul edilebilir.
6. Sonuçtan memnun iseniz tıklayarak geçen dizileri indirmek için seçebilirsiniz "Download." Dosyalar sıkıştırılmış klasör olarak indirilebilir olacak.
   * Not: "Ayarlar" altında dosya türü de dahil olmak üzere, indirme ve e-posta seçenekleri seçebilirsiniz.
7. Temiz üç nüsha dizileri üretmek için başarısız Örnekleri ekstresinden elde edilen üç nüsha olarak reamplified olmalıdır. RePCR temiz bir dizi sağlamak için başarısız olursa, en az 2 dizilerinin tropizm çıkarım kullanmak için kabul edilebilir.

9 - Viral tropizm Geno2pheno Co-reseptör Algoritma kullanılarak nüfus tabanlı Sıralama tarafından oluşturuldu Diziler çıkarım.

1. Http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php: Diziler, aşağıdaki URL geno2pheno coreceptor hizmeti aracılığıyla çalıştırmak olabilir.
2. Yüklemek için Numuneler uygun gördüğü şekilde etiketli olabilir. Önemini ayar menüsü açılan, "(% 2 ve% 5,75 FPR) motive klinik veri analizine göre optimize kesilecek" seçin
3. Analizi için bir dizi yükleyebilir veya yapıştırmak için seçin, Fasta dosyaları kabul edilir.
4. Geno2pheno FPR şöyle yorumlanabilir: G2P FPR> 5.75 R5-viral nüfusun temsilcisi; CCR5 antagonistleri cevap muhtemelen G2P FPR <5.75, non-R5 viral nüfusun temsilcisi; CCR5 antagonistleri yanıt vermemektedirler. G2P <2 CCR5 antagonistleri herhangi bir yanıt olması pek olası değildir. Bir örneklem üzerinden üç dizileri herhangi bir non-R5 anlaşılmaktadır ise, hastanın bir CCR5-antagonist cevap vermek için olası değildir.

10 Temsilcisi Sonuçlar

Protokol doğru yapıldığında bir başarıyla dizisi 2 veya 3 her bir örnek için çoğaltır beklemelisiniz. RNA örnekleri yanında çalıştırmak Olumsuz hiçbir göstergesi olmalıdır. Dizilerinin büyük çoğunluğu geri çağırma tarafından basecalling "pass" olmalı.

R5 ve non-R5 topluluk viral nüfus içindeki dağılımı dayanarak, rastgele seçilmiş hasta numunelerinin çoğunluğu virüs R5 kullanarak beklenir. Proje tasarımı, aksi öneriyoruz Bu nedenle sürece, bir non-R5 örneklere göre daha fazla R5 beklemelisiniz.

Tablo 1: A) Bir Adım RT-PCR ve RT-PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için gerekli B) PCR programı 1 reaksiyon için gerekli olan reaktif hacimlerini.

A)

Reaktif	Hacim (mcL) (1X tepki)
DEPC su tedavi	10,56
2x reaksiyon tamponu	20
% 50 ve 0.04% sakaroz Bromophenol mavi karışımı	4
İleri astar SQV3F1	0,32
Ters astar CO602	0,32
Enzim - Üst Simge III Platinum Taq DNA Polimeraz Bir Adım RT-PCR Sistemi	0,8
Toplam	36

* Not:
SQV3F1 astar sırası: 5 'GAG CCA ATT CCC ATA KAT TAT TGT 3'
CO602 astar sırası: 5 'GCC CAT AGT GCT TTK TGC TGC TTK CAA GAA CC 3'

B)

Hayır. Çevrimleri	Zaman	Sıcaklık
1	30 dakika	52 ° C
1	2minutes	94 ° C
40	15seconds	94 ° C
	30seconds	55 ° C
	1.5minutes	68 ° C
1	5minutes	68 ° C

Tablo 2. A) 1, ikinci turda PCR reaksiyon ve ikinci tur PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için gerekli B) PCR programı için gerekli reaktif hacimlerini .

A)

Reaktif	Hacim (mcL) (1X tepki)
DEPC su tedavi	13,45
% 60 sakaroz,% 0.08 kresol kırmızı karışımı	2
Roche HiFi sistemi Tampon 2	2
MgCl 2	0,8
dNTP	0,16
İleri astar SQV3F2	0,15
Ters astar CD4R	0,15
HiFi enzim genişletin	0,29
Toplam	19

* Not:
SQV3F2 astar sırası: 5 '3 TGT GCC CCA GCT GGT TTT GCG'
CD4R astar sırası: 5 'TAT AAT TCA CTT CTC CAA TTG TTK 3'

B)

Hayır. Çevrimleri	Zaman	Sıcaklık
1	2minutes	94 ° C
35	15seconds	94 ° C
30seconds	55 ° C
1 dakika	72 ° C
1	7minutes	72 ° C

Tablo 3: A) 1 sıralama reaksiyon ve sıralama tepki yürütmek için gerekli B) PCR programı için gerekli reaktif hacimlerini.

A)

Reaktif	Hacim (mcL) (1X tepki)
BigDye	0,3
BigDye Tampon	2,1
Astar boya İleri V3FO2F SQV3R1 Ters	2,6
Toplam	5,0

* Not: primerler birleştirmek ETMEYİN; her astar için hazırlanan ayrı bir karışımı olmalıdır
V3O2F astar sırası: 5 'AAT GTC AGY ACA GTA CAA TGT ACA C 3'
SQV3R1 astar sırası: 5 'GAA AAA TTC SKK TTK ACA ATT AAA 3'

B)

Hayır. Çevrimleri	Zaman	Sıcaklık
25	10seconds	96 ° C
5seconds	50 ° C
55seconds	60 ° C

Tartışmalar

Burada sunulan yöntem tropizm test uygulanan standart bir sıralama yöntemi. Geç sınırlı kadar viral tropizm tahmin sıralama HIV zarf V3 döngü klinik uygulama vardır. Bu yöntem, en az eşit klinik kullanılan diğer valide deneyleri ile karşılaştırıldığında viral tropizm tahmin etmek mümkün Maraviroc (ViiV Sağlık) klinik çalışmalarda retrospektif analizler gösterilir olmuştur.

Tropizm tahmini için V3 döngü genotipik analizi yapan pek çok faydaları vardır. Birincisi ve en önemlisi, bu yordamı erişilebilirliğini önemli ölçüde artan ve tropizm test dönüş süresini azaltmak, operasyonel sıralama ekipmanları ile herhangi bir tesiste olabilir. Buna karşılık, tropizm test etmek için altın standart olarak hizmet vermiştir fenotipik Geliştirilmiş Hassasiyet Trofile Assay (ESTA) (Monogram Biosciences), Güney Kaliforniya'da tek bir merkezden yapılır. Ek faydaları daha az başlangıç ​​materyali ve 500copies/mL gerekli minimum plazma viral yük ihtiyacını. Yanı sıra, genotipik analiz çalışan operasyonel maliyetlerini fenotipik bir testin kıyasla nispeten düşük. Özellikle hatırlama yazılımı kullanımı genotip analizleri emek yoğun bir parçası olma eğilimindedir manuel sıra eleştiri, gereksinimini ortadan kaldırır.

Burada sunulan yöntem, belirli bir adım önemi başka bir outweighing oldukça basittir. Biz, örnek bir viral nüfus içinde azınlık türlerin yakalama oran artırmak için üç nüsha olarak PCR ve sıralama çalıştırmanızı öneririz. Üçten çoğaltır daha büyük yapılabilir ancak biz bulduk, hem verimli ve güvenilir olması için triplicates. Ayrıca, yüksek duyarlılık ve özgüllük korurken aynı tepki olarak RT-PCR ve ilk tur PCR gerçekleştiren One-Step Reverse Transcriptase PCR kiti (Qiagen) kullanmanızı öneririz.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0
NucliSens easyMAG Magnetic Silica	bioMerieux	cat. # 280133	(48 x 0.6 ml)
NucliSens easyMAG Lysis Buffer	bioMerieux	cat. # 280134	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1	bioMerieux	cat. # 280130	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2	bioMerieux	cat. # 280131	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3	bioMerieux	cat. # 280132	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG version 1.0	bioMerieux
Class II A2 biological safety cabinet
One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR
DEPC-treated water	Ambion	cat. # 9922
SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty	Invitrogen	cat#12574-035	Kit components used: - SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix - 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4)
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	cat. # 1 759 078	Kit components used:- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2)- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl)- MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4)
dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP	Roche Group	cat. # 11969064001	(100 mM)
Sucrose	Sigma-Aldrich	cat. # S0389-500G
Bromophenol blue sodium salt	Sigma-Aldrich	cat.# B5525
Cresol Red	Sigma-Aldrich	cat.# 114472-5G	indicator grade
Thermocycler
Gel Electrophoresis
50X TAE buffer	Invitrogen	cat. # 24710030	(1000 ml)
SYBR Safe DNA gel stain	Invitrogen	cat. # S33102
Agarose (ultra pure)	Invitrogen	cat. # 15510-027
E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder	Invitrogen	cat. # 12373-031
Reagent Grade Type II water
Gel apparatus
Sequencing
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit	Applied Biosciences	cat. # 4337458	(25000 reactions)
Hi-Di Formamide	Applied Biosciences	cat. # 4311320
Sodium Acetate (NaOAc)	Sigma-Aldrich	cat. # S-2889
EDTA	Sigma-Aldrich	Cat.# 03690-100ML	0.5M, pH=8.0
TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution	Sigma-Aldrich	cat. # T-2819	1 M, pH 9.0
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. # M-1028	1 M
95% Ethanol
Running Buffer (10X) with EDTA	Applied Biosystems	cat. # 4335613	500 mL
Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL)	Applied Biosystems	cat. # 44363929 or cat. # 4352759
3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit	Applied Biosciences	Cat# 4336943
Thermocycler
Centrifuge with plate holders
3730xl DNA Analyzer	Applied Biosciences