Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Özet

Yaşayan hayvanların bakteriyel enfeksiyonlar biyoparlaklık görüntüleme yöntemleri açıklanmıştır. Patojenler, canlı hayvanlarda enfeksiyon optik tüm vücut görüntüleme sağlayan lusiferaz ifade etmek için modifiye edilmiştir. Hayvan modelleri lusiferaz ifade patojenler ile enfekte olan ve hastalık ortaya çıkan ders biyoparlaklık görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak görüntülenebilmekte.

Özet

Görüntüleme biyolojik süreçleri izlemek için kullanılan değerli bir tekniktir. Özellikle, kanser hücreleri, kök hücreleri, spesifik immün hücre tipleri, viral patojenler, parazit ve bakterilerin varlığı hayvanlar ^1-2 yaşam içinde gerçek zamanlı olarak takip edilebilir. Patojenlerin çalışmaya biyoparlaklık görüntüleme Uygulama ^3-4 hayvan modellerinde enfeksiyon analiz için geleneksel stratejiler kıyasla avantajları vardır. Enfeksiyonlar, zamanla patojenin yerini ve miktarını belirlemek için ötenazi gerektirmeden bireysel hayvanlar içinde görüntülenir olabilir. Optik görüntüleme, daha önce enfekte olduğu bilinen sitelerin örnekleme yerine, tüm doku ve organları kapsamlı inceleme sağlar. Buna ek olarak, belirli dokulara aşılama doğruluğunu doğrudan başarısız tüm deney boyunca ekildi önce ileri hayvanları taşıyan belirlenir. Görüntüleme, her hayvan ayrı ayrı takip edilmesi gereken hayvanlar arasında değişkenlik, kontrol edilebilir. Görüntüleme çünkü yeteneği ^3-4 patojen yükü belirlemek için örnek dokulara kalmadan birçok noktadan veri elde etmek için gereken hayvan sayısının büyük ölçüde azaltma potansiyeli vardır.

Bu protokol, canlı hayvanlarda enfeksiyonlara lusiferaz ifade rekombinant bakteri suşları için biyoparlaklık görüntüleme kullanarak görselleştirmek için yöntemler anlatılmaktadır. Tıklayın böceği (CBRLuc) ve ateşböceği luciferases (FFluc) bir substrat luciferase ^5-6 olarak kullanmaktadır. CBRluc ve FFluc tarafından üretilen ışık, canlı hayvan ^modelleri 7-9 optik görüntüleme için bu luciferases mükemmel gazetecilere, 500 nm'den 700 nm'ye kadar geniş bir dalga boyu vardır. 600 nm'den daha fazla ışık dalga boyu, hemoglobin tarafından emilimini önlemek ve böylece verimli memeli doku yoluyla seyahat etmek gereklidir, çünkü bu öncelikle. Lusiferaz genetik ışık sinyali üretmek için ¹⁰ bakteri girmiş. Fare akciğer enfeksiyonları gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak intratrakeal bioluminescent bakteri inoküle. Luciferase enjeksiyondan sonra, görüntüler IVIS Görüntüleme Sistemi kullanılarak elde edilir. Görüntüleme sırasında, fare XGI-8 Gaz Anethesia Sistemi kullanılarak izofluran anestezisi. Görüntüler, yerelleştirme ve sinyal kaynağını, sırasıyla, bakteriyel enfeksiyon site (ler) ve sayı temsil eden ölçmek için analiz edilebilir. Görüntüleme sonra, CFU belirlenmesi bakteri varlığını doğrulamak için homojenize dokusu üzerinde yapılır. Bakterilerin çeşitli dozlarda lüminesans bakteri sayısı ilişkilendirmek için kullanılır. Görüntüleme patogenezi ve antibakteriyel bileşikler ve aşıların etkinliğini değerlendirme çalışması yapılabilir.

Protokol

1. Intratrakeal Entübasyon tarafından Akciğer Enfeksiyonu

1. Fareler tartılır ve isteğe bağlı olarak, işaretleri kulaklara kolay tanımlanması için yapılabilir.
2. Intraperitoneal inokülasyon ile fareler anestezi ketamin (g fare kilo başına 100 mikrogram) ve xylazine (farenin ağırlığının gramı başına 10 mikrogram).
3. Tam anestezi kadar kafeslere yerleştirin fareler. Pedal refleks kontrol etmek için onların ayak pedleri sıkıştırın. Fare azaltılmış ya da herhangi bir refleks reaksiyon göstermesi gerekir.
4. Sırtında uzanan entübasyon standı üzerinde fare yerleştirin.
5. Entübasyon durmak için bir lastik bant saptamak ve sonra farenin üst kesici dişlerin altına koyun. Entübasyon standı üzerine bacaklar ve kollar düzeltmek için bant kullanın.
6. Forseps kullanarak ağız hafifçe dışarı tougue taşıyın.
7. Ağız içinde octoscope spekulum yerleştirin ve gırtlak açılması görülene kadar orofarinks içine bakmak.
8. Catether hub kadar trakea içine kateteri ile kaplı Advance kılavuz tel kesiciler. Kılavuz teli çıkarın. Göğüs genişlemesi gözlemlemek ve doğru entübasyon onaylamak için, kateteri içine hava koyun.
9. 50 mcL bakteriyel 1 ml şırınga kullanarak kateteri yoluyla çözüm (Bacillus Calmette Guerin (BCG) laboratuvarında inşa tıklayın böceği kırmızı lusiferaz (CBRLuc), ifade kullanılır, ancak herhangi bir ışıldayan bakteri suşunun kullanılabilir gösterilir görüntüleri) enjekte edilir.
10. Fare bir kafes yerleştirin ve anestezi kurtarma sırasında gözlemlemek.

2. Hayvan Anesthetization ve Biyoparlaklık Görüntüleme Hazırlık

Fareler XGI-8 Gaz Aneshesia Sistemi kullanılarak izofluran anestezisi.

1. XGI-8 anestezi sistemi çalıştırmadan önce, her bir kömür filtre spreyi tartmak ve ağırlığı ve tarih yazmak. 50 gram ağırlığı başlangıç ​​ağırlığının üzerinde ise, yeni bir teneke kutu ile değiştirin.
2. Buharlaştırıcı izofluran seviyesini kontrol edin ve gerekirse doldurun.
3. XGI-8 anestezi sistemi ön tahliye pompası açın ve 8 lpm (minuite litre) olarak ayarlanır.
4. , Yüksek basınçlı silindir oksijen kaynağı açın ve 55 psig olarak ayarlayın.
5. XGI-8 anestezi sistemi ön geçiş oksijen (yeşil) açın.
6. Gaz akışı seviyesini ayarlamak için görüntüleme odasına gaz akışını açın. 0.25 lpm ayarlayın ve ardından gaz akışı kapatın.
7. Gaz akışı seviyesini ayarlamak için anestezi indüksiyonu odasına gaz akışını açın. 1.5 lpm ayarlayın ve ardından gaz akışı kapatın.
8. Buharlaştırıcı ve yüzde 2-2.5 seti ile izofluran açın. Izofluran düzeyde kullanılan hayvanların ve kilo sayısına bağlı olarak ayarlanabilir.
9. Indüksiyon odasına fareler koyun ve kapağını kapatın. Indüksiyon odasına gaz akışını açın. 5 oda yerleştirin fareler - 10 minuites tamamen uyutmak kadar.
10. Gözlerin optik fare görüntüleme sırasında gözleri korumak ve görüntüleme odasında fareler anestezi manifoldunun üzerine burun konileri biri yere merhem sürün. Fareler arasındaki ışık baffle bitişik hayvan konular üzerine ışık yansımalarını önlemek için kullanın.
11. Intraperitoneal inokülasyon ile luciferase (150 mikrogram / gram vücut ağırlığı) enjekte edilir.

3. Biyoparlaklık Görüntüleme

1. Yaşayan Görüntüleme Yazılımı başlatın.
2. Sistemi başlatılmadı ise, IVIS Görüntüleme sistemi başlatmak.
3. IVIS satın alma kontrol paneli sıra kurulum tıklayarak görüntüleme parametreleri ayarlayın.
   Görüntüleme Modu lüminesans ve fotoğraf seçin. DLIT 3D rekonstrüksiyon yürütmek için seçenek istenirse, görüntü dizisinin bir parçası olarak, fotoğraf, parlak ve yapısal ışık görüntüleri seçin.
   Pozlama süresi 0.5 saniye ile 10 dakika arasında ayarlayın.
   Set binning ve F / örnek beklenen parlaklık dayalı duracaktır.
   Sadece belirli dalga boylarında ışık elde etmek için planlama sürece, açmak için blok ve filtre emisyon filtre uyarma ayarlayın. DLIT 3D anayasa durumda, farklı dalga boylarında birden fazla emisyon kaynağı doğru lokalizasyon izin filtreleri ayarlayabilirsiniz.
   Fare ya da hayvan bölgeye yansıması sayısına göre A'dan D'ye kadar FOV ayarlayın. 4-5 fareler için 1 fare, C ve D 2-3 fareler için A ve B seçin.
4. Resim Sihirbazı, Kazanç Kontrol Paneli sıra kurulum eklemek için ekle düğmesine tıklayın.
5. Elde tıklayarak görüntüleme sırası başlayın.
   DLIT 3D inşaat halinde, Işıklı görüntüler, farklı dalga boylarında birden fazla emisyon filtreler için alınacaktır. Fotografik ve yapılandırılmış ışık görüntüleri de kazanılmış olacaktır.
6. Satın alma sırasında görüntü ve görüntü seviyeleri paneller düzenlemek görünür olacaktır. Sonraki zamanlarda görüntüleri kolay takibi sağlamak ve görüntüleri kaydetmek için resim düzenleme her bir deney için mümkün olduğunca ayrıntılı bilgi olarak doldurun.
7. IVIS görüntüleme odasının fareler ReRemove ve onları kendi kafeslerine geri. Bir kurtarma dikkatfareler sağlamak için esthesia yordam tarafından önemli ölçüde etkilenmemiştir. Hayvanlar sürekli tam anestezi kurtarmak (genellikle 1-2 dakika) kadar izlenmelidir.

4. ex vivo Görüntüleme ve Akciğerler Bakterilerin Niceleme CFU Analizi

1. Ötenazi hemen önce, görüntüleme için aynı şekilde luciferase intraperitoneal farelere enjekte edilir.
2. Luciferase enjeksiyondan sonra 100 mg / kg pentobarbitol 5 dakika intraperitoneal fareler Euthanize.
3. Steril forseps ve makas kullanılarak steril Petri-yemekleri fareler ve yerden akciğerlere Eksplant.
4. Yeri Petri yemek görüntüleme odasında eksplante organı içeren ve tüm fare için aynı şekilde biyoparlaklık görüntüler elde.
5. Görüntüleme sonra, steril forseps kullanılarak petri eksplante organı kaldırmak ve 1 mL PBS içinde homojenize.
6. Dilüsyonları ve plaka dokusu uygun seçici besiyerleri olun. Homojenize doku yeniden kaplama için gerekli olmalıdır -80 ° C saklanabilir. Alternatif olarak, homojen doku RNA veya DNA ekstraksiyonu qPCR bakteri sayıları ölçmek için kullanılabilir.

5. Lüminesans Görüntüleme Analizi

1. "Yaşayan Görüntüleme Yazılımı" Başlat ve görüntü dosyalarını taramak.
2. Görüntüleri ayarlamak için "Aracı Paleti 'kullanın. Görüntü düzeltme / ayarlar ve ayrı renk ölçekler için min / max filtreleme değiştirmek için tıklayın ayarlayın.
3. Işık şiddetinin ölçülmesi için açılan listesinde ROI araçlarını kullanın. ROI şekli seçin, sayısı ve boyutu. Drag ROI resmin üzerine ilgi bölgeye çerçevesi. Tüm yatırım getirisi aynı boyut ve şekil olduğundan emin olun. Tıklayın yatırım getirisini ölçme ve kaydetme, kopyalama ve / veya nicel veri ihracat.
4. DLIT 3D rekonstrüksiyonlar durumunda, yapısal ışık görüntü de dahil olmak üzere görüntü sırası yükleyin. Platte Aracı yüzey topoğrafyası tıklayın. Açılan listesinde, yüzey topoğrafyasını oluşturmak için yeniden yapılandırma sekmesini tıklatın. Bir yüzey karışıklık sonra pencerede görünecektir.
5. Aracı Platte DLIT 3D rekonstrüksiyon seçin. Açılan listesinde, doku özellikleri ve kaynak spektrumu ayarlamak için Özellikler sekmesini tıklatın. Kas, pek çok koşulda tavsiye edilir. Analiz için dalga boyu seçmek için açılan listesinde, analiz sekmesini tıklatın. Parametre sekmesini tıklatın ve varsayılan değerleri onaylamak veya gerekirse DLIT parametrelerini ayarlamak. 3D analiz başlatmak için Yeniden İnşa sekmesini tıklayın.
6. 3D rekonstrüksiyon bittiğinde, 3D görünümü 3 boyutlu rekonstrüksiyon sonuçları gösterecektir. Foton yoğunluğu, vokseller ve DLIT algoritma parametreleri için analiz verileri görmek için sonuçları sekmesine tıklayın.
7. Kaydet ve / veya 3 boyutlu rekonstrüksiyon analizlerin sonuçları ihracat rakamları ve veri dosyalarının içine.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

Bulaşmamış bir fare kontrolü ile birlikte bioluminescent bakteri ile enfekte farelerde biyoparlaklık görüntüleri Şekil 1'de gösterilmiştir. Bioluminescent bakteri ile enfekte farelerde pulmoner akciğerler (Şekil 1) önemli bir sinyal üretir. Lüminesans yoğunluğu içinde toplam akı bir yatırım getirisi (ilgi bölgesi) (Şekil 2) olarak belirlendi. Işık şiddeti için nicel veri sinyal bioluminescent bakteri elde edilir ve negatif kontrol ile karşılaştırıldığında onaylamak için akciğerlere elde edilen bakteri koloni oluşturan birim (CFU) için normalize. Sinyal konumu ve yoğunluğu daha da fare yüzeyinin ¹¹ tomografi lüminesans kaynak DLIT 3D rekonstrüksiyon ile analiz edilebilir. Bu analizler, üretilen bioluminescent sinyal ölçümlerini ve lokalizasyonu izin verir. Işıklı enfekte farelerde kaynağı 3D rekonstrüksiyon sonuçları o ışık fare akciğerler (Şekil 3) elde edilir göstermektedir. Bu lüminesans teyit çıkan fare akciğerlerin ex vivo görüntüleri oldukça yakından yan yana bazı diğer doku ya da organ (Şekil 2C) daha akciğerlere yayılan.

Şekil 1. CBRluc tagged with bioluminescent bakteriler ile pulmoner bulaşmış farelerin Lüminesans görüntüleme. Bulaşmamış kontrolü fare solda ve sağda iki enfekte olmuş fareler vardır. Fareler intratrakeal yolla CBRluc (n = 2) ifade bakteri ile enfekte edildi. Sırt, karın, sol tarafında ve sağ tarafında luciferase enjeksiyondan sonra 10 dakika, 4 pozisyon az 10 dakika lüminesans görüntüleri elde edildi.

Şekil 2. CBRluc ifade bakteri ile enfekte farelerden alınan kantitatif ışık şiddeti (A, B) ROI analizi ve dorsal ve ventral pozisyonda ROI ışık sayısal toplam akı Lüminesans görüntüleri, sırasıyla. Bulaşmamış fareler solda ve sağda iki enfekte olmuş fareler vardır. Akciğerler o Lüminesans görüntüler elde edilmiştirf fareler bulaşmamış CBRlux ile enfekte (n = 2). Akciğerler etrafında ışık yoğunluğu ROI analizi ile belirlendi. C) bulaşmamış (üstte) ve enfekte (alt akciğerlerin iki takım) farelerden alınan akciğerlerin ex vivo görüntüleri. Sonra önce ötanazi ve görüntüleri elde edildi luciferase 5 miniuts enjekte edildi. CFU sayısal değerler normalize edilir.

Şekil 3. Pulmoner enfekte fare biyoparlaklık kaynak (lar) 3D rekonstrüksiyon fare CBRluc intratrakeal enjeksiyon yoluyla ifade bakteri ile enfekte oldu. Görüntü sırası seri 540 nm ila 700 nm dalga boylarında farklı emisyon filtreler kullanılarak elde edilmiştir. Bir görüntü dizisi lüminesans kaynağı için yapılandırılmış bir imag içeren hayvan konularda 3D sulandırıldıktan için kullanılmıştır. A) fare tomografi farklı pozisyonlarda gösterilen: ön, arka, sağ ve sol. Işık kaynakları, yeniden yapılanma tarafından belirlendiği gibi akciğer içinde yer vokseller (3D fare içinde kırmızı kutu) olarak gösterilir. B) ölçülen ve simüle edilmiş veri Foton densiy harita. Ölçülen ve simüle foton yoğunluğu eğrileri yeniden inşa kalitesi bilgi vermek karşılaştırılması. Benzer ölçülen ve simüle foton yoğunlukları kaliteli rekonstrüksiyonlar sonucudur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokoller genellikle yüksek kaliteli görüntüler neden olmakla birlikte, bu görüntüleme çalışmalarından elde edilen doğru ve tutarlı verilerin elde etmek için birkaç temel sorunları dikkate almak önemlidir. Lüminesans görüntü sinyali arka plan üzerinde ve kamera doymuş değildir sağlamak için 600 ila 60.000 sayımlar elde edilmelidir. Elde edilen sinyal 600 den az ise maruz kalma koşullarını sayımı artırmak için ayarlanabilir olmalıdır. 60.000 'den fazla elde edilen sinyal ise, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	VETONE	501027
Ketamine	Butler Animal Health Supply
Xylazine	MP Biomedicals	158307
Luciferin	GMT	LUCK-100
Fetal plus solution	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd
Cathether (22G x 1”)	Terumo Medical Corp.	OX2225CA
Guide wire	Hallowell EMC	210A3491
Octocope with speculum	Hallowell EMC	000A3748
Xenogen IVIS system	Caliper Life Sciences
XGI-8-gas Anesthsia System	Caliper Life Sciences
Living Imaging Software	Caliper Life Sciences
Transparent nose cones	Caliper Life Sciences
Light baffle divider	Caliper Life Sciences